Idrogeli con sferoidi di cellule staminali adipose per interventi mini-invasivi di rigenerazione ossea o cartilaginea

Introduzione Lo xiloglucano (XG) è un polisaccaride sia di struttura che di riserva, perché svolge il ruolo di matrice nelle pareti cellulari delle piante superiori ma è anche presente in alcuni semi, tra i quali tamarindo. Lo xiloglucano da semi di tamarindo è disponibile in commercio, è un polimero biocompatibile, approvato dalla FDA per uso alimentare. È caratterizzato da uno scheletro di b-(1, 4)-D-glucano parzialmente sostituito da a-(1, 6)-D-xilosio e b-(1, 2)-D- galattossilosio. La scissione enzimatica di alcuni dei residui di galattosio fornisce allo XG proprietà di gelificazione indotte da variazioni di temperatura. In particolare, quando viene rimosso il 35% circa dei residui di galattosio, le dispersioni acquose di XG parzialmente degalattosilato (dXG) sono caratterizzate da una temperatura di transizione sol-gel di ~25 °C ed una temperatura di transizione gel-sol di ~100 °C. Quindi, dXG può essere utilizzato come polimero che gelifica in situ a temperatura corporea (37 °C). [1] Soluzioni polimeriche biocompatibili mescolate a cellule staminali possono essere molto utili per interventi mini- invasivi di rigenerazione tissutale che intendono sfruttare l’elevato potenziale rigenerativo di queste cellule. La formazione del gel nel sito di iniezione può evitare la diffusione incontrollata delle cellule e favorire l’integrazione del tessuto di neoformazione con quelli circostanti; può fornire alle cellule staminali le migliori condizioni per la loro sopravvivenza, per il differenziamento e la proliferazione. La disponibilità di cellule staminali di qualità è un aspetto altrettanto importante. Le cellule staminali mesenchimali isolate da tessuto adiposo (ASC) hanno il vantaggio di essere abbondanti e pluripotenti. Se isolate sotto forma di sferoidi tridimensionali (SASCs) sono caratterizzate da un più alto potenziale rigenerativo. [2] Abbiamo di recente dimostrato che l'incorporazione di SASCs in idrogeli di dXG contenti opportuni fattori solubili è una metodologia efficace per garantire la vitalità delle SASCs e preservarne la staminalità. [3] Si è perseguito quindi l’obiettivo di dimostrare che attraverso la semplice modificazione del mezzo condizionante aggiunto insieme alle SASCs alle dispersioni di dXG sia possibile indurre il loro differenziamento in osteoblasti o in condrociti e che queste formulazioni siano effettivamente iniettabili. Sono allo studio anche le correlazioni tra la struttura e le proprietà del gel, la loro evoluzione nel tempo e la risposta cellulare in termini di colonizzazione dello scaffold e potenziale di rigenerazione dei tessuti. Materiali e metodi Materiali Xiloglucano degalattosilato (dXG), grado di degalattosilazione: 45%; sferoidi di cellule staminali adopose umane (SASCs); StemPro® Chondrogenesis Differentiation kit (CDM); StemPro® Osteogenesis Differentiation Kit (ODM). Reggio Calabria, 5-8 Settembre 2021 AICIng 2021 1 Volumi noti delle dispersioni polimeriche di dXG (2%p, 3%p e 5%p) e sono stati miscelati con uguali volumi di acqua, CDM o ODM ed incubati a 37 °C per 10 min (T0), 7giorni (T7) e 21 giorni (T21). Le analisi reologiche sono state eseguite utilizzando un reometro AR G2 (TA Instruments): a 25 °C per le misure di viscosità; a 37 °C, nell'intervallo di frequenza 0.1-10 Hz e con uno strain di circa 7x10-3 per le misure dinamico-meccaniche in frequenza. Le indagini morfologiche sono state condotte con un microscopio a scansione elettronica (FESEM-JEOL) a 10kV su idrogeli liofilizzati. I test di rigonfiamento ed erosione in PBS sono stati eseguiti attraverso misure gravimetriche dopo incubazione a 37 °C per intervalli di tempo prestabiliti. L’iniettabilità delle formulazioni è stata valutata attraverso misure reologiche e di stress-strain con un Instron 3365 collegando la traversa ad una siringa con ago 23G. I test di vitalità MTS delle SASCs negli idrogeli sono stati eseguiti a 7 e 21 giorni. Il differenziamento è stato valutato dopo 21 giorni di coltura in CDM o ODM, attraverso misure di immunofluorescenza e di reazione a catena della polimerasi Reverse (RT-PCR) sulle cellule recuperate dagli idrogel per la ricerca di opportuni geni di differenziamento e molecole di adesione. Risultati e discussione Metodi La caratterizzazione reologica degli idrogeli ottenuti da dispersioni di dXG a tre concentrazioni mescolate con CDM o ODM (dXG1, dXG1.5 e dXG2.5) evidenzia un ruolo importante sia della concentrazione di dXG che della natura del mezzo. Tutte le formulazioni a T0 hanno il tipico comportamento reologico dei gel, con modulo elastico G' maggiore del modulo di dissipazione viscosa, G”. Tuttavia, per dXG1, G’ e G” sono relativamente bassi (<102 Pa) ed ancora significativamente influenzati dalla frequenza, segno della formazione di una rete disomogenea in termini di densità di reticolazione. A più alta concentrazione di polimero, i moduli diventano indipendenti dalla frequenza e più elevati (102-103 Pa). È interessante osservare che, specialmente in presenza dei mezzi condizionanti, i moduli dei gel aumentano dopo 7 giorni e, per dXG1.5 e dXG2.5, anche dopo 21 giorni di incubazione, segno di una progressiva riorganizzazione delle catene in un network più fitto ed interconnesso. I valori di G’ per dXG1-ODM a T7 sono cresciuti più di un ordine di grandezza. Le analisi morfologiche SEM confermano le modificazioni della struttura del gel per effetto dei mezzi condizionanti ed in funzione del tempo di incubazione. La morfologia dei gel con ODM e CDM presenta in genere pori di maggiori dimensioni ed una maggiore tendenza del dXG ad assemblarsi in cordoni o lamelle. Il mescolamento con le SASCs non comporta significative variazioni di viscosità delle dispersioni ed un leggero incremento dei moduli elastici dei gel ottenuti. Il gel che si è formato dopo estrusione dal sottile ago della siringa ha le stesse caratteristiche del sistema non iniettato. Se estruso con le SASCs mostra invece variazioni non sistematiche di G’ e G” come possibile effetto della disgregazione degli sferoidi di maggiori dimensioni. Tutti i sistemi sono risultati iniettabili con una forza di iniezione inferiore a 20 N, quindi facili da applicare. Sono in corso gli studi di vitalità cellulare dopo iniezione. La caratterizzazione biologica delle SASCs coltivate nei gel per 21 giorni dimostra, per tutte le formulazioni, una crescita cellulare superiore al controllo, che per dXG1 con CDM è anche più di 10 volte superiore. Le misure di immunofluorescenza confermano la presenza esclusiva di condrociti o di osteoblasti, rispettivamente in presenza di CDM e OCM. È allo studio l’espressione genica di molecole di adesione coinvolte nell’interazione cellula-cellula e cellula-matrice.