Regolazione genica e biomineralizzazione in embrioni di riccio di mare.

Gli echinodermi possiedono un esteso endoscheletro composto da calcite di magnesio, una forma di carbonato di calcio che contiene piccole quantità di carbonato di magnesio e di proteine occluse nella matrice [1]. Nell’ambito del progetto europeo del 7FP Biomintec 2008-2012 (http://www.biomintec.de/), focalizzato sui meccanismi molecolari che stanno alla base dei processi di biomineralizzazione e volto alla futura applicazione di nuovi biomateriali, abbiamo studiato gli effetti della deprivazione di magnesio sullo sviluppo dell’embrione di riccio di mare Arbacia lixula. Gli embrioni sono stati analizzati morfologicamente, valutando l’impatto sullo sviluppo a vari stadi (3, 6, 24, 48 e 72 ore). Tramite ibridazione in situ (ISH) e Western Blotting (WB) sono stati valutati: la localizzazione del trascritto (mRNA) di una proteina della matrice scheletrica (msp130); i livelli della proteina p38MAPk, nota per la sua implicazione nella scheletogenesi embrionale. L’osservazione morfologica mediante microscopia ottica ha messo in evidenza un generale rallentamento dello sviluppo, visibile già allo stadio di morula (6 ore), l’assenza di formazione minerale dopo 24 ore, e gravi malformazioni scheletriche dopo 48-72 ore. Tramite l’uso di marcatori molecolari (WGA-FITC) abbiamo osservato mediante microscopia a fluorescenza la localizzazione ectopica delle cellule del mesenchima primario (PMCs), le uniche cellule deputate alla formazione dello scheletro. Inoltre, mediante ISH abbiamo valutato la trascrizione del gene PMC-specifico msp130, dimostrando la presenza di alti livelli del trascritto in tutte le PMCs anche a 48 ore di sviluppo, a differenza di quanto accade negli embrioni controllo in cui solo una parte delle PMCs sono marcate e per un tempo minore. A livello proteico, mediante WB abbiamo dimostrato un aumento nei livelli di p38MAPk rispetto agli embrioni controllo. Risultati preliminari indicano livelli proteici costanti di hsp70. Esperimenti in corso sono volti all’analisi dei profili di espressione spazio-temporale di alcuni geni implicati nella scheletogenesi, tra cui msp130, SM30, SM50, p16, p19, VEGF, VEGFR [1-3], mediante l’uso delle specifiche sonde molecolari prodotte nel nostro laboratorio. Ulteriori esperimenti saranno necessari per accertare il ruolo del magnesio nel complesso processo di biomineralizzazione, attraverso la quantificazione del contenuto interno di calcio e la determinazione delle forme polimorfiche di carbonato di calcio presenti nelle spicole degli embrioni coltivati in assenza di magnesio in confronto agli embrioni controllo [4]. Alcuni dei risultati sono parte della tesi di laurea magistrale in Biologia Cellulare e Molecolare di Chiara Martino, di cui è stato relatore la Chiar.ma Prof.ssa Maria Carmela Roccheri del Dipartimento di Scienze e Tecnologiche Biologiche, Chimiche e Farmaceutiche dell’Università degli Studi di Palermo. Bibliografia [1] Matranga V, Bonaventura R, Costa C, Karakostis K, Pinsino A, Russo R, Zito F. (2011) Echinoderms as blueprints for biocalcification: regulation of skeletogenic genes and matrices. Prog Mol Subcell Biol 52:225-48. [2] Pinsino A, Roccheri MC, Costa C, Matranga V. (2011) Manganese interferes with calcium, perturbs ERK signaling, and produces embryos with no skeleton. Toxicol Sci 123:217-230. [3] Costa C, Karakostis K, Zito F, Matranga V. (2012) Phylogenetic analysis and expression patterns of p16 and p19 in Paracentrotus lividus embryos. Dev Genes Evol 222:245-51. [4] Raz S, Hamilton PC, Wilt FH, Weiner S, Addadi L. (2003) The transient phase of amorphous calcium carbonate in sea urchin larval spicules: the involvement of proteins and magnesium ions in its formation and stabilization. Adv Mater 13:480-486.