Miscele di k-carragenina e PVA come bio-inchiostri per stampa 3D di scaffold per la ricostruzione della cartilagine

Introduzione La k-carragenina (kC) è un poligalattano solfato ottenuto da alghe rosse con un contenuto di estere-solfato dal 25 al 30% e una peso molecolare medio ben superiore a 100 kDa. È formato da unità alternate di D-galattosio e 3,6-anidro-galattosio (3,6-AG) unite da legami α-1,3 e β-1,4-glicosidici. [1] Il kC assomiglia ai glicosaminoglicani (GAG) che sono i costituenti centrali dei tessuti connettivi, può essere quindi studiato per produrre scaffold per l'ingegneria tissutale. Il kC è solubile in acqua a temperature superiori a 60 °C e può formare gel stabili raffreddandosi. Le reti di kC sono forti, fragili e l'assenza di porosità interconnesse può limitare la colonizzazione dell'impalcatura da parte delle cellule e l'accesso di nutrienti e ossigeno. Le miscele di kC con altri polimeri più resistenti, come l'alcol polivinilico (PVA), possono migliorarne le proprietà meccaniche e creare porosità.[2] Gli idrogeli sono spesso usati come bio-inchiostri per i processi di stampa 3D che mirano a ricostruire la matrice extracellulare di tessuti relativamente molli. La possibilità di stampare parti del corpo danneggiate o mancanti sulla base di un disegno assistito da computer (CAD) promette la realizzazione di strutture specifiche per il paziente. [3] Le proprietà fisico-chimiche e biologiche dell'idrogelo devono essere armonizzate con il comportamento viscoelastico della formulazione durante e dopo l'estrusione dall'ugello di stampa. Gli idrogel reticolati fisicamente sono spesso preferiti rispetto ai sistemi reticolati chimicamente perché non richiedono la presenza di iniziatori e catalizzatori, che potrebbero indurre citotossicità e richiedere una purificazione accurata. Il nostro studio esplora l'idoneità dei sistemi acquosi di kC/PVA con tre diversi rapporti di peso tra i due polimeri per la stampa 3D di scaffold per la ricostruzione della cartilagine. Materiali e metodi Ingredienti k-carragenina (kC) fornita Gelcarin ME 8625 FMC; polvere di alcol polivinilico (PVA), con peso molecolare di 146000-186000 e grado di idrolisi del 99+% fornita da Sigma-Aldrich; mezzo di coltura per sferoidi di cellule staminali (SCM); terreno di coltura StemPro® Chondrogenesis Differentiation Kit (CDM). Procedura Le soluzioni di PVA/kC sono state preparate alle seguenti composizioni: PVA 2%w e kC 4%w, PVA 3%w e kC 3%w, PVA 4%w e kC 2%w. Le soluzioni sono state fatte raffreddare a temperatura ambiente per una notte (FT0). Sono poi stati eseguiti cicli di congelamento-scongelamento (FT) per reticolare fisicamente il PVA, congelando gli idrogeli per 2 ore e scongelandoli per 2 ore due volte al giorno per un giorno (FT1) e per cinque giorni consecutivi (FT5). La spettroscopia infrarossa a trasformata di Fourier a riflettanza totale attenuata (ATR-FTIR) dei campioni liofilizzati è stata condotta con uno spettrofotometro Perkin-Elmer Spectrum Two accumulando 32 scansioni tra 4000-400 cm-1, con una risoluzione di 4 cm-1. Le analisi reologiche sono state eseguite utilizzando un reometro AR G2 (TA Instruments): a 90 °C per le misure di viscosità; a 37 °C, nell'intervallo di frequenza 0.1-10 Hz e con uno strain di circa 8x10-4 per le misure dinamico-meccaniche in frequenza; a 1 Hz, variando la temperatura da 90 °C a 25 °C a 1 °C/min e 10 °C/min e con uno strain di 5×10-4 per le misure a scansione in temperatura (T). Le indagini morfologiche sono state condotte con un microscopio a scansione elettronica (SEM) a 10kV su idrogeli liofilizzati. I test di rigonfiamento ed erosione in PBS sono stati eseguiti attraverso misure gravimetriche dopo incubazione a 37 °C per intervalli di tempo prestabiliti. Le prove meccaniche a compressione stress-strain sono state eseguite con un Instron 3365. Le prove di stampabilità 3D sono state eseguite con una stampante Dr ROKIT Invivo. I test di vitalità MTS delle SASCs negli idrogeli sono stati eseguiti a 21 giorni in presenza del terreno SCM e in condizioni di differenziamento con CDM. Risultati e discussione Per la produzione dello scaffold, la ricerca si è basata sullo studio della morfologia e le proprietà meccaniche, stampabilità e sulla compatibilità con cellule staminali. Dalle analisi FTIR, le miscele di PVA/kC hanno mostrato i tipici picchi dei singoli componenti senza far evincere nessuna interazione funzionale fra i polimeri coinvolti. Dalle analisi di viscosità risulta che quest’ultima aumenta all’aumentare della concentrazione di kC e presenta un andamento psudoplastico. I valori di viscosità ottenuti rendono queste soluzioni adatte alla stampa 3D sia mediante laser-induced forward transfer (LIFT) che dosatura robotizzata (estrusione). Dall’analisi reologica di scansione in frequenza risultano valori di storage modulus e loss modulus caratteristici dei gel forti. I sistemi mostrano un aumento dei moduli all’aumentare della concentrazione di kC. Inoltre i moduli diminuiscono all’aumentare dei cicli FT poiché questi ultimi vanno a intaccare la coerenza strutturale del kC senza rafforzare sufficientemente il PVA. Dall’analisi reologica di scansione in temperatura risulta che la transizione sol-gel delle miscele avviene in un intervallo di T molto ristretto e minimo a 60 °C (una T troppo alta per mescolare i sistemi con le cellule). Dalle prove meccaniche a compressione i sistemi risultano avere una deformazione a rottura e una tensione a rottura più alta all’aumentare della concentrazione di kC, ma la deformazione massima sopportata prima della rottura aumenta all’aumentare dei cicli FT. I test di rigonfiamento ed erosione in tampone fosfato (PBS) mostrano che tutti i sistemi presentano un rigonfiamento iniziale seguito da lenta erosione. Se condizionati con mezzo di coltura cellulare SCM o CDM, i gel presentano un minimo rigonfiamento che non comporta uno stravolgimento della geometria iniziale. L'analisi al SEM mostra una struttura più porosa per le miscele di kC e PVA rispetto a quelle di solo kC, rendendo le miscele potenzialmente più colonizzabili dalle cellule. Dalle prove di stampaggio 3D la miscela PVA 4%w / kC 2%w risulta l’unica stampabile senza creare problemi di gelazione nell’ago, avvalorando il PVA come plasticizzante per il kC. Dai test di vitalità MTS risulta che la vitalità cellulare è stata preservata in SCM per due delle tre formulazioni, mentre è stato osservato un aumento significativo della vitalità cellulare per tutte le formulazioni quando le cellule sono state coltivate in CDM. Bibliografia [1] J.T. Oliveira, R.L. Reis, J. Tissue Eng. Regen. Med., 5, 421-36, (2011). [2] J. Necas, L. Bartosikova, Veterinarni Medicina, 58, 187–205, (2013). [3] Y. Zhang, L. Ye, M. Cui, B. Yang, J. Li, H. Sun, F. Yao, RSC Adv., 5(95), 78180-78191, (2015).