USE OF IN VITRO TISSUE CULTURE IN PROPAGATION AND GENETIC IMPROVEMENT OF FRUIT TREES

In vitro culture, applied to the propagation and genetic improvement of plant biodiversity, can be an effective tool to face current problems such as climate change, and new consumer needs. Moreover, it can take on a strategic role in genetic improvement and propagation of cultivars in order to obtain genotypes resistant to biotic and abiotic stresses, with fruits improved from an organoleptic point of view and plants able to adapt to climate change. Genetic improvement through conventional methods is limited by many factors. Fruit trees are characterized by a long period of juvenitlity, high heterozygosity and, very often, by sexual incompatibility. The in vitro techniques of the cultivation of isolated anthers and/or microspores, to obtain haploid or double haploid plants, are able to overcome some limits of traditional genetic improvement and provide in a single step completely homozygous lines of interest for genomic studies, mutations, mapping and genetic transformation. In addition, in vitro technology is a complementary method or can even support conventional methods of agamic propagation, since the plant material is protected from possible attacks by pathogens, their production is independent of seasonal conditions, this tecquique allows genetic uniformity and high multiplication rates, in a small space. In vitro culture is made possible by the phenomenon of totipotency, that is, the ability of cells, organs or tissues to de-differentiate and acquire meristematic skills, giving rise to organs, tissues or to an entire individual, even different from the original one. This research had as its objective the induction of gametic embryogenesis in various citrus genotypes through in vitro culture of anthers, and the development of an efficient protocol for Fig, Hop and Caper through synthetic seed technology and micropropagation, respectively. The experiments were conducted in 2017, 2018 and 2019 at the University of Palermo (UNIPA) and the Valencian Institute of Agricultural Research (IVIA). As far as the cultivation of citrus anthers is concerned, somatic embryogenesis was obtained in the Moro variety (2x), leading to the regeneration of embryos which after ploidy and molecular analyzes were heterozygous tetraploids; and Marisol (4x), Clemenules (4x), Moro Los Valles (4x), Sanguinelli (4x) and Sanguinelli (2) genotypes, symmetric division of the nucleus, multinucleated structures and formation of embryos that following the analysis was observed cytofluorimetric results for the most part were diploid, molecular analysis, carried out with SSR markers instead, found singular results, in fact, in the Marisol, Clemenules and Sanguinelli genotypes (2x and 4x), even if multinucleated microspores and the most regenerated were diploid, from the analysis they were all heterozygous, while in Moro Los Valles, the markers found that three regenerated diploids were homozygous, two mutated homozygotes (gametoclonal variability) and two mutated heterozygotes.In this research, synthetic seed technology has been applied to the Houmairi variety of Ficus carica L., in particular, the effect of two “Plant rowth Re ulators” (P R): 6-benzylaminopurine (BAP) and meta-Topolina (mT), added to the artificial endosperm, and of the preservation at 4 ° C for 30 days of the encapsulated microcuttings. The highest percentage of viable seeds that led to a greater vegetative recovery occurred in the thesis that it did not foresee cold storage before sowing and when the artificial endosperm was added with BAP. In a different way, the highest percentage of conversion occurred, both for the stored seeds and not when the endosperm was added with mT. In vitro propagation was applied to the Cascade, variety of Humulus lupulus L. with the aim of achieving an efficient micropropagation protocol. Starting from the collection in the field of the plant material, sterilization, stabilization of the aseptic culture as well as the multiplication, rooting and acclimatization to ex vitro conditions were carried out. For the multiplication 3 PGR were tested: BAP, mT and Thidiazuron (TDZ) in different combinations, while for the rooting 2 PGR auxinic: indole-3-acetic acid (IAA) and indole-3-butyric acid (IBA). The TDZ / BAP interaction showed the highest germination rate even though with a greater callus development such as to consider the medium with 2 mg lˉ¹ of TDZ the best despite giving a lower budding as well as for the presence of callus. As regards the greater percentage of rooting, it occurred in the medium containing 2mg lˉ¹ of IBA without significant difference from the medium that contained 1 mg L of IAA. Finally, the influence of the calcium alginate coating the cuttings along with the three different growth regulators (PGR) were evaluated: 6-benzylaminopurine (BAP), meta-topolina (mT) and zeatin (ZEA), on vitality, regrowth and the conversion of the propagules of two Sicilian genotypes of Capparis spinosa (L.) (Tracino and Scauri, from Pantelleria Island). Caper microcutting have been sectioned and placed in different artificial endosperms based on Murashige and Skoog, enriched with mT or ZEA or BAP. The synthetic seeds obtained were seeded on an MS medium added with 0.4 mg / L of naphthalene acetic acid and 0.7 mg / L of gibelleric acid. After 60 days, the following parameters were detected: vitality, regrowth, number and length of shoots and roots, conversion. The results confirm that encapsulation did not negatively affect vitality, which showed the highest percentage with BAP in Tracino and with ZEA in Scauri. Similar results were obtained in regrowth, with statistically significant differences between the three PGRs tested: Tracino showed the best regrowth in capsules enriched with BAP, Scauri with ZEA. Furthermore, synseed conversion was strongly influenced by PGR and was higher in artificial endosperm added with BAP in Tracino and ZEA in Scauri genotype.

La coltura in vitro, applicata alla propagazione e miglioramento genetico della biodiversità vegetale, può rappresentare uno strumento efficace per affrontare i problemi attuali come i cambiamenti climatici, le nuove esigenze dei consumatori e indirettamente lo sviluppo delle aree rurali. Inoltre, può assumere un ruolo strategico nel miglioramento genetico e nella propagazione delle cultivar al fine di ottenere genotipi resistenti, con frutti migliori dal punto di vista organolettico e piante capaci di adattarsi ai cambiamenti climatici. Il miglioramento genetico attraverso i metodi convenzionale è limitato da molti fattori infatti, gli alberi da frutto sono caratterizzati da un lungo periodo di giovanilità, elevata eterozigosi e molto spesso incompatibilità sessuale. La tecniche in vitro della coltura di antere e/o microspore isolate, per ottenere piante aploidi o doppi aploidi, riescono a superare alcuni limiti del miglioramento genetico tradizionale e fornire in un solo passaggio linee completamente omozigoti interessanti per studi di genomica, mutazioni, mappatura e trasformazione genetica. La tecnologia in vitro oltre ad essere applicata al miglioramento genetico, risulta un metodo complementare ai metodi convenzionali di propagazione agamica, in quanto, il materiale vegetale risulta protetto da eventuali attacchi di patogeni, il processo è indipendente dalle condizioni stagionali, permette uniformità genetica ed elevati tassi di moltiplicazione in uno spazio ridotto. La coltura in vitro è resa possibile dal fenomeno della totipotenza; cioè la capacità che hanno le cellule, organi o tessuti di de-differenziarsi e acquisire capacità meristematiche dando origine ad organi, tessuti o a un individuo intero, anche diverso da quello di partenza. Questa ricerca ha avuto come obiettivo l’induzione dell’embrio enesi ametica in vari genotipi di agrumi, tramite coltura in vitro di antere. Inoltre, si è studiata la messa a punto di un efficiente protocollo di conservazione e propagazione, attraverso la tecnologia del seme sintetico, rispettivamente in Fico, Luppolo e Cappero. Gli esperimenti sono stati condotti nel 2017, 2018 e 2019 presso l’Universit de li Studi di Palermo (UNIPA) e l’Instituto Valenciano de Investi aciones A rarias (IVIA). Per quanto riguarda la coltura di antere di agrumi è stata ottenuta embriogenesi somatica nella varietà Moro (2x), portando alla rigenerazione di embrioni che dopo le analisi della ploidia e molecolari sono risultati tetraploidi eterozigoti; nei genotipi Marisol (4x), Clemenules (4x), Moro Los Valles (4x), Sanguinelli (4x) e Sanguinelli (2), è stata osservata divisione simmetrica del nucleo, strutture multinucleate e la formazione di embrioni che in se uito all’analisi citofluorimetrica sono risultati per la maggior parte diploidi. L’analisi molecolare, effettuata con i marcatori SSR invece, ha rilevato risultati singolari, infatti, nei genotipi Marisol, Clemenules e Sanguinelli (2x e 4x), anche se sono state osservate microspore multinucleate e la maggior parte dei rigenerati erano diploidi, dall’analisi sono risultati tutti eterozi oti, mentre in Moro Los Valles, imarcatori hanno rilevato che dei diploidi rigenerati tre erano omozigoti, due omozigoti mutati (variabilità gametoclonale) e due eterozigoti mutati. La tecnologia del seme sintetico è stata applicata alla varietà Houmairi di Ficus carica L., in particolare, è stato valutato l’effetto di due Regolatori di crescita (PGR): 6-benzilaminopurine (BAP) e meta-Topolina (mT), aggiunti all’endosperma artificiale, e della conservazione a 4° C per 30 iorni delle microtalee incapsulate. La più alta percentuale di semi vitali e che hanno portato ad una maggiore ripresa vegetativa si è avuta nella tesi che non ha previsto conservazione a freddo prima della semina e quando l’endosperma artificiale veniva addizionato con il BAP. In maniera diversa, la percentuale maggiore di conversione si è avuta, sia per i semi conservati che non quando l’endosperma veniva addizionato con mT. La propagazione in vitro, è stata applicata anche, alla varietà Cascade di Humulus lupulus L. con l’obiettivo di realizzare un protocollo efficiente di micropropagazione. Partendo dal prelievo in campo del materiale vegetale, si è proceduto alla sterilizzazione, stabilizzazione della coltura asettica nonché alla moltiplicazione, radicazione e acclimatazione alle condizioni ex vitro. Per la moltiplicazione sono stati testati 3 PGR: BAP, mT e Thidiazuron (TDZ) in diverse combinazioni, mentre per la radicazioni 2 PGR auxinici: Acido indol-3-acetico (IAA) e Acido indol-3-butirrico (IBA). L’interazione TDZ/BAP ha mostrato il più alto tasso di germogliamento anche se con un maggiore sviluppo di callo tale da considerare il mezzo con 2mg Lˉ¹ di TDZ il migliore nonostante dia un germogliamento inferiore così come per la presenza di callo. Per quanto riguarda la maggiore percentuale di radicazione si è avuta nel mezzo contenente 2 mg Lˉ¹ di IBA anche se differiva per pochi punti percentuali dal mezzo che conteneva 1 mg Lˉ¹ di IAA. Infine, è stata valutata l’influenza del rivestimento di alginato di calcio e di tre diversi regolatori di crescita (PGR): 6-benzilaminopurina (BAP), meta-topolina (mT) e zeatina (ZEA), sulla vitalità, la ricrescita e la conversione dei propaguli. di due genotipi siciliani di Capparis spinosa (L.). Le microtalee di cappero sono state sezionate e collocate in diversi endospermi artificiali a base di sali e vitamine Murashige e Skoog, arricchiti di mT o ZEA o BAP. I semi sintetici ottenuti sono stati seminati su un mezzo MS addizionato con 0,4 mg / Lˉ¹ di acido acetico naftalenico e 0,7 mg / Lˉ¹ di acido gibellerico. Dopo 60 giorni, sono stati rilevati i seguenti parametri: vitalità, ricrescita, numero e lunghezza dei germogli e delle radici, conversione. I risultati confermano che l'incapsulamento non ha influito negativamente sulla vitalità, che ha mostrato la percentuale più alta con BAP in Tracino e con ZEA in Scauri. Risultati simili sono stati ottenuti nella ricrescita, con differenze statisticamente significative tra i tre PGR testati: Tracino ha mostrato la migliore ricrescita in capsule arricchite con BAP, Scauri con ZEA. Inoltre, la conversione dei semi sintetici è stata fortemente influenzata dalla PGR ed era più elevata nell'endosperma artificiale addizionato con BAP in Tracino e ZEA in Scauri.