Obiettivi specifici: Le mutazioni nonsenso (mutazioni STOP), un difetto genetico frequente negli individui affetti da Fibrosi Cistica (CF), causano la sintesi di proteine CFTR tronche e non funzionanti che sono associate ad un fenotipo più severo della CF (McKone EF. et al., Chest 2006). L’obiettivo del nostro studio è stato quello di disegnare derivati dell’Ataluren (PTC124), una ‘small molecule’ a cui è stata attribuita attività readthrough, e valutarne l’attività su tre differenti sistemi modello sperimentali contenenti codoni di STOP prematuri (UGA, UAG, UAA). Materiali e metodi: Sono state sintetizzate 24 molecole derivate dal PTC124 e analizzate mediante tecniche spettroscopiche per valutare la loro struttura molecolare e il loro grado di purezza. Per valutare la capacità readthrough, è stato usato (1) un vettore reporter (FLuc190) in cui è presente la mutazione UGA nella porzione codificante FLuc e (2) il plasmide pBOS-H2BGFP in cui, mediante mutagenesi sito specifica, sono stati alternativamente introdotti nella porzione codificante la proteina GFP i tre diversi tipi di codoni di stop (UGA, UAG, UAA). Il DNA plasmidico è stato purificato e isolato dai batteri mediante ‘Colony PCR’, sottoposto a PCR-selettiva e sequenziato. Cellule HeLa sono state quindi trasfettate con i vettori contenenti la mutazione STOP, inoltre sono state anche utilizzate cellule IB3.1 (FC) per valutare la ri-espressione della proteina CFTR. Entrambe i tipi cellulari sono stati trattati con i differenti derivati del PTC124 la cui attività è stata verificata mediante osservazione diretta al microscopio a fluorescenza, saggi enzimatici e immunofluorescenza indiretta. Risultati: Lo screening funzionale che fa uso del vettore in cui è clonato il gene della Luciferasi contenente la mutazione di stop UGA (opal), sui 24 derivati del PTC124 ha permesso l’identificazione di tre molecole (derivati: #1, #3 e #5) che mostrano una attività readthrough superiore al PTC124. Tale risposta risulta evidente anche nel ‘recoding’ dell’espressione della proteina H2BGFP in cellule HeLa esprimenti il vettore reporter pBOS-H2BGFP-opal, la cui presenza è stata messa in evidenza in vivo/in vitro e mediante analisi di immunofluorescenza indiretta. Per quanto riguarda gli altri due codoni di stop, UAG, UAA (amber e ochre), i nostri risultati dimostrano che una delle molecole (#3) che aveva dato un buon risultato sulla mutazione UGA (opal) sembra avere anche un buon effetto nel recupero della proteina H2BGFP nelle cellule HeLa H2BGFP-amber (UAG). Al contrario nelle cellule HeLa H2BGFP-ochre (UAA), nessuna delle molecole testate ha dato un risultato positivo. Esperimenti condotti sulle cellule IB3.1 (F508/W1282X) hanno messo in evidenza a 24 ore dal trattamento con il derivato #5 l’incremento della quantità della proteina CFTR attribuibile probabilmente a readthrough della mutazione nonsense. Questo risultato è ancora più evidente dopo 10 giorni di trattamento continuato in cui il derivato #5 è stato aggiunto ogni 24 ore. Conclusioni: La ricerca ha identificato tre molecole, tra le 24 da noi disegnate e sintetizzate, in grado di indurre il readthrough delle mutazioni di stop premature, in particolare della mutazione UGA (opal). Inoltre, al contrario degli amminoglicosidi, i trattamenti con i derivati del PTC124 non presentano tossicità a livello cellulare, indice del fatto che tali molecole potrebbero trovare una migliore applicazione in sostituzione alla terapia con gli antibiotici amminoglicosidi.

Lentini, L., Melfi, R., Pibiri, I., Pace, A., Di Leonardo, A. (2013). AZIONE READTHROUGH DI DERIVATI DEL PTC124 SU SISTEMI MODELLO CELLULARI E IN CELLULE DI EPITELIO BRONCHIALE-FC IB3.1 (CFTR F508/W1282X ). In XIX CONGRESSO NAZIONALE SOCIETA’ ITALIANA PER LO STUDIO DELLA FIBROSI CISTICA.

AZIONE READTHROUGH DI DERIVATI DEL PTC124 SU SISTEMI MODELLO CELLULARI E IN CELLULE DI EPITELIO BRONCHIALE-FC IB3.1 (CFTR F508/W1282X )

LENTINI, Laura;MELFI, Raffaella;PIBIRI, Ivana;PACE, Andrea;DI LEONARDO, Aldo
2013-01-01

Abstract

Obiettivi specifici: Le mutazioni nonsenso (mutazioni STOP), un difetto genetico frequente negli individui affetti da Fibrosi Cistica (CF), causano la sintesi di proteine CFTR tronche e non funzionanti che sono associate ad un fenotipo più severo della CF (McKone EF. et al., Chest 2006). L’obiettivo del nostro studio è stato quello di disegnare derivati dell’Ataluren (PTC124), una ‘small molecule’ a cui è stata attribuita attività readthrough, e valutarne l’attività su tre differenti sistemi modello sperimentali contenenti codoni di STOP prematuri (UGA, UAG, UAA). Materiali e metodi: Sono state sintetizzate 24 molecole derivate dal PTC124 e analizzate mediante tecniche spettroscopiche per valutare la loro struttura molecolare e il loro grado di purezza. Per valutare la capacità readthrough, è stato usato (1) un vettore reporter (FLuc190) in cui è presente la mutazione UGA nella porzione codificante FLuc e (2) il plasmide pBOS-H2BGFP in cui, mediante mutagenesi sito specifica, sono stati alternativamente introdotti nella porzione codificante la proteina GFP i tre diversi tipi di codoni di stop (UGA, UAG, UAA). Il DNA plasmidico è stato purificato e isolato dai batteri mediante ‘Colony PCR’, sottoposto a PCR-selettiva e sequenziato. Cellule HeLa sono state quindi trasfettate con i vettori contenenti la mutazione STOP, inoltre sono state anche utilizzate cellule IB3.1 (FC) per valutare la ri-espressione della proteina CFTR. Entrambe i tipi cellulari sono stati trattati con i differenti derivati del PTC124 la cui attività è stata verificata mediante osservazione diretta al microscopio a fluorescenza, saggi enzimatici e immunofluorescenza indiretta. Risultati: Lo screening funzionale che fa uso del vettore in cui è clonato il gene della Luciferasi contenente la mutazione di stop UGA (opal), sui 24 derivati del PTC124 ha permesso l’identificazione di tre molecole (derivati: #1, #3 e #5) che mostrano una attività readthrough superiore al PTC124. Tale risposta risulta evidente anche nel ‘recoding’ dell’espressione della proteina H2BGFP in cellule HeLa esprimenti il vettore reporter pBOS-H2BGFP-opal, la cui presenza è stata messa in evidenza in vivo/in vitro e mediante analisi di immunofluorescenza indiretta. Per quanto riguarda gli altri due codoni di stop, UAG, UAA (amber e ochre), i nostri risultati dimostrano che una delle molecole (#3) che aveva dato un buon risultato sulla mutazione UGA (opal) sembra avere anche un buon effetto nel recupero della proteina H2BGFP nelle cellule HeLa H2BGFP-amber (UAG). Al contrario nelle cellule HeLa H2BGFP-ochre (UAA), nessuna delle molecole testate ha dato un risultato positivo. Esperimenti condotti sulle cellule IB3.1 (F508/W1282X) hanno messo in evidenza a 24 ore dal trattamento con il derivato #5 l’incremento della quantità della proteina CFTR attribuibile probabilmente a readthrough della mutazione nonsense. Questo risultato è ancora più evidente dopo 10 giorni di trattamento continuato in cui il derivato #5 è stato aggiunto ogni 24 ore. Conclusioni: La ricerca ha identificato tre molecole, tra le 24 da noi disegnate e sintetizzate, in grado di indurre il readthrough delle mutazioni di stop premature, in particolare della mutazione UGA (opal). Inoltre, al contrario degli amminoglicosidi, i trattamenti con i derivati del PTC124 non presentano tossicità a livello cellulare, indice del fatto che tali molecole potrebbero trovare una migliore applicazione in sostituzione alla terapia con gli antibiotici amminoglicosidi.
Settore BIO/18 - Genetica
Settore CHIM/06 - Chimica Organica
2013
XIX CONGRESSO NAZIONALE SOCIETA’ ITALIANA PER LO STUDIO DELLA FIBROSI CISTICA
Città del Mare- Terrasini- Palermo
Novembre 2013
2013
1
Lentini, L., Melfi, R., Pibiri, I., Pace, A., Di Leonardo, A. (2013). AZIONE READTHROUGH DI DERIVATI DEL PTC124 SU SISTEMI MODELLO CELLULARI E IN CELLULE DI EPITELIO BRONCHIALE-FC IB3.1 (CFTR F508/W1282X ). In XIX CONGRESSO NAZIONALE SOCIETA’ ITALIANA PER LO STUDIO DELLA FIBROSI CISTICA.
Proceedings (atti dei congressi)
Lentini, L; Melfi, R; Pibiri, I; Pace, A; Di Leonardo, A
File in questo prodotto:
Non ci sono file associati a questo prodotto.

I documenti in IRIS sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.

Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: https://hdl.handle.net/10447/88528
Citazioni
  • ???jsp.display-item.citation.pmc??? ND
  • Scopus ND
  • ???jsp.display-item.citation.isi??? ND
social impact