AZIONE READTHROUGH DI DERIVATI DEL PTC124 SU SISTEMI MODELLO CELLULARI E IN CELLULE DI EPITELIO BRONCHIALE-FC IB3.1 (CFTR F508/W1282X )

Obiettivi specifici: Le mutazioni nonsenso (mutazioni STOP), un difetto genetico frequente negli individui affetti da Fibrosi Cistica (CF), causano la sintesi di proteine CFTR tronche e non funzionanti che sono associate ad un fenotipo più severo della CF (McKone EF. et al., Chest 2006). L’obiettivo del nostro studio è stato quello di disegnare derivati dell’Ataluren (PTC124), una ‘small molecule’ a cui è stata attribuita attività readthrough, e valutarne l’attività su tre differenti sistemi modello sperimentali contenenti codoni di STOP prematuri (UGA, UAG, UAA). Materiali e metodi: Sono state sintetizzate 24 molecole derivate dal PTC124 e analizzate mediante tecniche spettroscopiche per valutare la loro struttura molecolare e il loro grado di purezza. Per valutare la capacità readthrough, è stato usato (1) un vettore reporter (FLuc190) in cui è presente la mutazione UGA nella porzione codificante FLuc e (2) il plasmide pBOS-H2BGFP in cui, mediante mutagenesi sito specifica, sono stati alternativamente introdotti nella porzione codificante la proteina GFP i tre diversi tipi di codoni di stop (UGA, UAG, UAA). Il DNA plasmidico è stato purificato e isolato dai batteri mediante ‘Colony PCR’, sottoposto a PCR-selettiva e sequenziato. Cellule HeLa sono state quindi trasfettate con i vettori contenenti la mutazione STOP, inoltre sono state anche utilizzate cellule IB3.1 (FC) per valutare la ri-espressione della proteina CFTR. Entrambe i tipi cellulari sono stati trattati con i differenti derivati del PTC124 la cui attività è stata verificata mediante osservazione diretta al microscopio a fluorescenza, saggi enzimatici e immunofluorescenza indiretta. Risultati: Lo screening funzionale che fa uso del vettore in cui è clonato il gene della Luciferasi contenente la mutazione di stop UGA (opal), sui 24 derivati del PTC124 ha permesso l’identificazione di tre molecole (derivati: #1, #3 e #5) che mostrano una attività readthrough superiore al PTC124. Tale risposta risulta evidente anche nel ‘recoding’ dell’espressione della proteina H2BGFP in cellule HeLa esprimenti il vettore reporter pBOS-H2BGFP-opal, la cui presenza è stata messa in evidenza in vivo/in vitro e mediante analisi di immunofluorescenza indiretta. Per quanto riguarda gli altri due codoni di stop, UAG, UAA (amber e ochre), i nostri risultati dimostrano che una delle molecole (#3) che aveva dato un buon risultato sulla mutazione UGA (opal) sembra avere anche un buon effetto nel recupero della proteina H2BGFP nelle cellule HeLa H2BGFP-amber (UAG). Al contrario nelle cellule HeLa H2BGFP-ochre (UAA), nessuna delle molecole testate ha dato un risultato positivo. Esperimenti condotti sulle cellule IB3.1 (F508/W1282X) hanno messo in evidenza a 24 ore dal trattamento con il derivato #5 l’incremento della quantità della proteina CFTR attribuibile probabilmente a readthrough della mutazione nonsense. Questo risultato è ancora più evidente dopo 10 giorni di trattamento continuato in cui il derivato #5 è stato aggiunto ogni 24 ore. Conclusioni: La ricerca ha identificato tre molecole, tra le 24 da noi disegnate e sintetizzate, in grado di indurre il readthrough delle mutazioni di stop premature, in particolare della mutazione UGA (opal). Inoltre, al contrario degli amminoglicosidi, i trattamenti con i derivati del PTC124 non presentano tossicità a livello cellulare, indice del fatto che tali molecole potrebbero trovare una migliore applicazione in sostituzione alla terapia con gli antibiotici amminoglicosidi.