STUDI RADIOBIOLOGICI DI COMPLESSI CHELANTE- RADIONUCLIDE DIRETTI AL TUMORE CON ATTIVITÀ DIAGNOSTICA E/O TERAPEUTICA SU MODELLO MURINO E VALUTAZIONE DELL'EFFICACIA BIOLOGICA UTILIZZANDO MODELLI DI INTELLIGENZA ARTIFICIALE E RADIOMICA SU IMMAGINI MICROPET/CT

Benfante, V.

Research in the field of oncology is increasingly challenging and stimulating, and requires collaboration between researchers from various scientific fields. Research and development of new, cutting-edge therapies and diagnostic techniques are increasingly the result of the work of multidisciplinary research teams, as collaboration across different disciplines allows for diverse perspectives and increasingly complementary approaches. This is particularly crucial for achieving comprehensive characterization of complex diseases such as various forms of cancer, which require increasingly innovative, less invasive, and personalized diagnostic and therapeutic solutions. The integration of systems that perform diagnostic and therapeutic functions simultaneously is becoming increasingly important in nuclear medicine. This branch of biomedical research is now known as Theranostics (from "THERApeutic" and "diagNOSTIC"). This research topic focuses on the design and synthesis of new biochemical-pharmaceutical compounds that can be used to achieve both goals simultaneously, that is, for the diagnosis and treatment of particular forms of cancer.Today, significant momentum is being gained in the research and development of innovative new nanosystems, radiopharmaceuticals, and increasingly stable and effective radionuclide chelators. This includes the production of novel radionuclides that, thanks to specific classes of ionizing radiation emitted, can be used both for Positron Emission Tomography (PET) and Single Photon Emission Computed Tomography (SPECT) imaging, and for direct action on target cells. These target cells, when exposed to ionizing radiation emitted by specific radionuclides massively concentrated in a given organ or tissue, suffer irreversible damage that leads to cell death.Nuclear medical imaging based on PET/CT aims to study the biochemical and physiological processes of the body's tissues. These methods can reveal whether an organ is compromised or whether some physiological "barrier" lacks the right permeability, and whether it is therefore undergoing pathological alteration. This is possible because PET imaging radiopharmaceuticals are absorbed into the target organs, exploiting chemical modifications that selectively target specific tumors while sparing healthy organs.Furthermore, depending on instrumentation and techniques (e.g., PET and/or SPECT), it is possible to use different classes of radionuclides. This is true because each radionuclide has unique physical and chemical characteristics, such as half-life, type of decay, type of ionizing radiation emitted, etc. These characteristics are the basis for selecting an instrument type (PET and/or SPECT), which, in turn, has different capabilities for detecting and capturing radioactive emissions. This latter aspect concerns the gamma camera and the radiation detection device, which is made of materials (crystals of different compositions and different scintillators) that vary depending on their purpose.Copper-64 (64Cu) is a radioisotope with unique properties from the perspective of nuclear medicine as it can be used both as a diagnostic and therapeutic agent. It can be used for radiolabeling bifunctional chelators carrying a wide range of pharmacophores targeting diverse biological substrates. Gallium-68 (68Ga) is a radionuclide used in the labeling of radiotracers applied to cancer diagnosis, particularly neuroendocrine and prostate tumors. Image-guided techniques are playing an increasingly significant role in the study of drug biodistribution and pharmacokinetics in various diseases, particularly cancer. Thus, PET and SPECT-based imaging are increasingly used to assess the biodistribution and uptake of theranostic radiopharmaceuticals.Although the uptake properties of radiopharmaceuticals at the tissue/organ level allow for an easy qualitative understanding of whether or not uptake is present at the tumor site, the quantitative evaluation of radiopharmaceuticals through PET and SPECT is still difficult to interpret.Indeed, PET imaging has low spatial resolution and lacks a clear anatomical frame of reference, making it difficult to accurately locate anatomical structures or lesions showing abnormal radiopharmaceutical accumulation. Therefore, to date, all these systems are combined with Computed Tomography (CT), which accurately scans and reveals the morphology of body regions, allowing the operator to superimpose the physiology of a tumor onto its morphology.Until 2001, only standalone, non-integrated PET and CT scanners were available for clinical use. However, it is possible to integrate separate sets of PET and CT images into a single study using well-known image fusion methods. A prototype integrated PET/CT scanner was developed in 1998 to address the challenges associated with fusing datasets obtained from standalone PET and CT scanners. This type of scanner provides high-quality clinical images for PET and CT, allowing for cost savings. The first integrated PET/CT system appeared in a clinic in 2001. Currently, all major vendors offer integrated PET/CT systems. The advantage of using these imaging techniques is that they also exist for preclinical testing, which is essential for making radiopharmaceutical testing fully translational, bringing the results of animal studies directly to the patient's bedside. Additionally, these devices offer higher resolution than clinical devices, which makes them particularly suitable for preclinical use.However, despite significant advances in clinical imaging analysis techniques, the analysis of preclinical small animal PET (microPET) imaging remains a hotly debated area, and is still in the development and implementation phase. This is due to two factors: firstly, research is progressing towards the creation of increasingly high-performance tools capable of extracting as much data and information as possible from each type of image. In contrast, studies are increasingly being conducted to develop workflows that can help apply the potential of these tools to animal models, even by professionals from different scientific fields. Indeed, these professionals do not always have a specialized training background in animal imaging and, being involved in this type of research, must be familiar with these analysis methods.Science uses radiomics to extract and analyze features (radiomic features), quantitative parameters extractable from biomedical images, and it has gained increasing attention in recent years not only in the predictive/prognostic field, but also for pre- and post-treatment quantification and comparison.Therefore, today's challenge is to broaden the horizons of preclinical PET imaging and the quantitative analysis of the uptake and biodistribution of innovative radiopharmaceuticals through increasingly minimally invasive methods.Through the analysis of nuclear medicine images, such as PET/SPECT co-registered with morphological CT images, it is possible to reveal in detail the underlying pathophysiology at the organ and tissue level. Radiomic features of a tumor can provide additional quantitative as well as qualitative information about tumor biology and behavior.This thesis develops an innovative workflow for the minimally invasive analysis of the biodistribution of novel theranostic compounds labeled with Copper-64 (Cu) and Gallium-64 (Ga) and targeted to tumors overexpressing the cholecystokinin 2 receptor, using microPET/CT imaging and artificial intelligence and radiomics algorithms.Specifically, this thesis covers the following topics:• An overview of the structure of Cu- and Ga-labeled radiopharmaceuticals, the definition of radionuclides, and description of positron emission tomography (PET) imaging techniques, with a specific focus on preclinical microPET/CT;• A novel preclinical decision support system based on PET radiomics: a preliminary study evaluating a novel Cu-labeled chelator in murine models;• Evaluation of the biodistribution of a novel Ga-labeled radiopharmaceutical in a CCK2R-overexpressing mouse cancer model: conventional and radiomic methods for analysis.Through the use of PET/CT imaging in theranostics, this thesis explores an innovative approach for assessing the biodistribution of novel radiopharmaceuticals in preclinical in vivo experiments.The research described involved the in vivo use of a novel chelator and radiopharmaceutical labeled with 64Cu and 68Ga, respectively, based on an innovative and minimally invasive approach via microPET/CT imaging. The aim of the work was to perform a quantitative analysis of the absorption and biodistribution of these compounds using artificial intelligence algorithms and radiomics analysis. Although further investigations are essential to validate the results, these studies lay the foundation for innovative translational theranostic approaches in oncology (Fig. 1). A new microPET/CT imaging analysis method was developed, which allows assessments to quantify absorbed radiopharmaceuticals, extracting new biomarkers directly from the images. The innovation of this research lies in the minimally invasive nature of this analysis method, considering that currently this type of study relies exclusively on histopathological quantification of each organ. Furthermore, radiomic analysis has been used only for predictive purposes and only in clinical settings until now.The results obtained could also be of assistance to scientific personnel involved in this type of study, who, at the same time, could greatly benefit from the use of a semi-automated workflow conducted with artificial intelligence and radiomics algorithms that can be used to support conventional methods of analyzing the biodistribution of radiopharmaceuticals.

Il campo dell’oncologia è sempre più oggetto di sfide insidiose e stimolanti e prevede un lavoro sinergico da parte di ricercatori appartenenti a differenti settori scientifici. La ricerca e sviluppo di nuove terapie e tecniche diagnostiche sempre più all’avanguardia sono sempre più spesso il risultato del lavoro di team di ricerca multidisciplinari in quanto la collaborazione di branche differenti della ricerca permette di avere punti di vista diversi e approcci sempre più complementari. In particolare, ciò è cruciale al fine di ottenere una caratterizzazione completa di patologie complesse come le varie forme di cancro, che necessitano di soluzioni diagnostiche e terapeutiche sempre più innovative, meno invasive e personalizzate. Nell’ambito della medicina nucleare è sempre più richiesta l’integrazione di sistemi che simultaneamente espletano funzione di diagnosi e di terapia. Tale branca della ricerca biomedica è oggi nota come Teranostica (da “TERApeutico” e “diagNOSTICo”). Alla base di questo topic vi è la progettazione e sintesi di nuovi composti biochimico-farmaceutici che possono essere utilizzati per raggiungere entrambi gli obiettivi contemporaneamente, ovvero per la diagnosi e la cura di particolari forme di cancro. Oggi, è notevole lo slancio che sta prendendo la branca della ricerca e sviluppo di nuovi nanosistemi innovativi, radiofarmaci, chelanti di radionuclidi sempre più performanti e stabili, oltre che la produzione di nuovi radionuclidi che, grazie a specifiche classi di radiazioni ionizzanti emesse, possono essere utilizzati sia per condurre imaging di Tomografia a Emissione di Positroni (PET) e Tomografia a Emissione di Singolo Fotone (SPECT), sia per svolgere un’azione diretta sulle cellule bersaglio. Tali cellule bersaglio, risentendo delle radiazioni ionizzanti emesse da particolari radionuclidi massivamente concentrati in un dato organo o tessuto, subiscono danni irreversibili che conducono a morte cellulare. L'imaging medico nucleare basato su PET/CT mira a studiare i processi biochimici e fisiologici dei tessuti del corpo. Grazie a queste metodiche è possibile scoprire se un organo è compromesso oppure se qualche “barriera” fisiologica ha o meno la giusta permeabilità, e se quest’ultima pertanto sta subendo un’alterazione per cause patologiche. Ciò è possibile in quanto i radiofarmaci per imaging PET vengono assorbiti a livello degli organi bersaglio, sfruttando modifiche che dal punto di vista chimico consentono l’ingresso di tali composti in modo selettivo nei confronti di specifici tumori, risparmiando gli organi sani. In base alle strumentazioni e tecniche (ad esempio, PET e/o SPECT) inoltre è possibile utilizzare classi differenti di radionuclidi. Ciò è vero dal momento che ciascun radionuclide è dotato di caratteristiche fisico-chimiche che lo rendono unico, come ad esempio emivita, tipo di decadimento, tipo di radiazioni ionizzanti emesse, ecc. E’ in base a queste caratteristiche che viene selezionato il tipo di strumento (PET e/o SPECT), che, a sua volta, vanta capacità differenti di detection e di cattura delle emissioni radioattive. Quest’ultimo aspetto riguarda la gamma camera e l’apparecchio di rivelazione di queste radiazioni, costituito da materiale (cristalli di differente composizione e differenti scintillatori) diverso in base allo scopo. Il Rame-64 (64Cu) è un radioisotopo con proprietà uniche dal punto di vista della medicina nucleare in quanto può essere utilizzato sia come agente diagnostico che terapeutico. Può essere utilizzato per la marcatura radioattiva di chelanti bifunzionali che trasportano una vasta gamma di farmacofori per colpire diversi substrati biologici. Il Gallio-68 (68Ga) è un radionuclide utilizzato nella marcatura di radiotraccianti usati per la diagnosi del cancro, in particolare dei tumori neuroendocrini e della prostata. La tecnica guidata dalle immagini sta giocando un ruolo sempre più importante nello studio della biodistribuzione e della farmacocinetica dei farmaci in varie malattie, in particolare nei tumori. Pertanto, l'imaging basato su PET e SPECT è sempre più utilizzato per valutare la biodistribuzione e l’assorbimento (uptake) dei radiofarmaci teranostici. Sebbene le proprietà di uptake dei radiofarmaci a livello dei tessuti/organi consenta di capire agevolmente dal punto di vista qualitativo se l’assorbimento è presente o meno a livello di un tumore, la valutazione quantitativa dei radiofarmaci attraverso PET e SPECT risulta ancora di difficile interpretazione. Infatti, l’imaging PET ha una bassa risoluzione spaziale e manca di un chiaro quadro di riferimento anatomico, il che rende difficile localizzare accuratamente strutture anatomiche o lesioni che mostrano un accumulo anomalo di radiofarmaci. Pertanto, ad oggi, tutti questi sistemi sono associati alla Tomografia Computerizzata (CT), che scansiona e rivela accuratamente la morfologia dei distretti corporei, consentendo all’operatore di sovrapporre la fisiologia di un tumore con la sua morfologia. Fino al 2001, per l’uso clinico erano disponibili solo scanner PET e CT autonomi e non integrati. Tuttavia, è possibile integrare set separati di immagini PET e CT in un unico studio utilizzando metodi ben noti di fusione delle immagini. Un prototipo di scanner PET/CT integrato è stato sviluppato nel 1998 per affrontare le sfide associate alla fusione di set di dati ottenuti da scanner PET e CT autonomi. Questo tipo di scanner fornisce immagini di elevata qualità clinica per PET e CT, consentendo un risparmio sui costi. Il primo sistema PET/CT integrato è apparso in ambito clinico nel 2001. Attualmente, tutti i principali fornitori offrono sistemi PET/CT integrati. Il vantaggio di usare queste tecniche di imaging è che esistono anche per sperimentazione preclinica, il che è fondamentale per rendere i test su radiofarmaci completamente traslazionali, portando i risultati dagli studi con modelli animali direttamente al letto del paziente. Inoltre, ciò che conferisce prestigio a questi dispositivi per uso preclinico è il fatto che la risoluzione è più elevata rispetto ai device per uso clinico. Tuttavia, nonostante le tecniche di analisi dell’imaging clinico abbia fatto notevoli progressi, l’analisi dell’imaging preclinico PET per piccoli animali (microPET) è un ambito ancora attualmente molto discusso e in fase di sviluppo e implementazione. La ragione di ciò è duplice e consiste nel fatto che, da una parte, la ricerca sta progredendo nella creazione di tool sempre più performanti e capaci di estrarre più dati e informazioni possibili da ciascun tipo di immagine, e, dall’altro lato, sempre più e attuali e in fase di implementazione risultano gli studi per sviluppare flussi di lavoro capaci di aiutare ad applicare le potenzialità di questi tool sui modelli animali, anche da parte di professionisti appartenenti a differenti settori scientifici. Tali operatori infatti, non sempre possiedono un background formativo specialistico nel settore dell’ imaging di modelli animali, e, essendo coinvolti in questo tipo di attività di ricerca, devono interfacciarsi con questi metodi di analisi. La scienza utilizza la radiomica per estrarre e analizzare caratteristiche (features radiomiche), parametri quantitativi estraibili da immagini biomediche, e sta guadagnando crescente attenzione negli ultimi anni non solo in ambito predittivo/prognostico, ma anche per la quantificazione e comparazione pre e post trattamento. Pertanto, la sfida odierna è quella di ampliare gli orizzonti dell’imaging PET preclinico e dell’analisi quantitativa dell’assorbimento e biodistribuzione di radiofarmaci innovativi attraverso metodiche sempre più mini invasive.Attraverso l'analisi delle immagini di medicina nucleare, quali PET/SPECT co- registrate con immagini morfologiche di CT, è possibile rivelare in dettaglio la fisiopatologia sottostante a livello di organi e tessuti. Le features radiomiche di un tumore possono fornire ulteriori informazioni quantitative oltre che qualitative sulla biologia e sul comportamento del tumore. Lo scopo di questa tesi è lo sviluppo di un flusso di lavoro innovativo per l’analisi mini invasiva della biodistribuzione di nuovi composti teranostici marcati con Rame-64 (64Cu) e Gallio-64 (68Ga) e diretti a tumori overesprimenti il recettore per la colecistochinina 2, attraverso imaging microPET/CT e algoritmi di intelligenza artificiale e radiomica. In particolare, i seguenti topic saranno trattati in questa tesi: • Una panoramica della struttura dei radiofarmaci marcati con 64Cu e 68Ga, definizione di radionuclidi e descrizione delle tecniche di imaging di tomografia ad emissione di positroni (PET), con un focus mirato sulla microPET/CT preclinica; • Un nuovo sistema di supporto decisionale preclinico basato sulla radiomica in PET: uno studio preliminare sulla valutazione di un innovativo chelante marcato con 64Cu in modelli murini; • Valutazione della biodistribuzione di un nuovo radiofarmaco marcato con 68Ga in un modello murino di cancro che sovraesprime CCK2R: metodi convenzionali e radiomici per l'analisi. Questa tesi affronta un approccio innovativo per la valutazione della biodistribuzione di nuovi radiofarmaci in esperimenti preclinici in vivo usando imaging PET/CT in ambito teranostico.La ricerca che verrà descritta ha previsto l’utilizzo in vivo di un nuovo chelante e radiofarmaco marcati con 64Cu e 68Ga rispettivamente, basati su un approccio innovativo e mini invasivo tramite imaging microPET/CT. Lo scopo del lavoro è stato quello di effettuare una analisi quantitativa dell’assorbimento e biodistribuzione di tali composti applicando algoritmi di intelligenza artificiale e l’analisi radiomica. Sebbene ulteriori indagini siano essenziali per validare i risultati, questi studi pongono le basi per approcci teranostici innovativi traslazionali da applicare in oncologia (Fig 1). È stato creato un nuovo metodo di analisi dell’imaging microPET/CT, che consente di effettuare delle valutazioni per quantificare i radiofarmaci assorbiti, estraendo nuovi biomarcatori direttamente dalle immagini. L’innovazione di questa ricerca risiede nella mini invasività di questo metodo di analisi, se si considera che attualmente questo tipo di studi fa uso esclusivamente della quantificazione istopatologica di ciascun organo. L’altro aspetto innovativo risiede nel fatto che fino ad oggi l’analisi radiomica è stata usata solo a scopo predittivo e solo in ambito clinico. Il risultato ottenuto potrà essere di aiuto anche al personale scientifico coinvolto in questo genere di studi, che, contestualmente, potrebbe trarre ampiamente vantaggio dall’utilizzo di un flusso di lavoro semi automatizzato condotto con algoritmi di intelligenza artificiale e Radiomica da poter usare a supporto dei metodi convenzionali di analisi della biodistribuzione dei radiofarmaci.

Benfante, V. (2024). STUDI RADIOBIOLOGICI DI COMPLESSI CHELANTE- RADIONUCLIDE DIRETTI AL TUMORE CON ATTIVITÀ DIAGNOSTICA E/O TERAPEUTICA SU MODELLO MURINO E VALUTAZIONE DELL'EFFICACIA BIOLOGICA UTILIZZANDO MODELLI DI INTELLIGENZA ARTIFICIALE E RADIOMICA SU IMMAGINI MICROPET/CT. (Tesi di dottorato, Università degli Studi di Palermo, 2024).