Ecology of virus and virus-like diseases that affect olive trees in the Mediterranean basin

The cultivation of olive tree (Olea europaea L.) has significant historical and socio-economic importance, especially in Mediterranean regions (Brunori et al., 2020). Due to the increasing global demand for olives and olive oil, modern agricultural practices, such as establishing high-density orchards and implementing irrigation systems have been employed (Mili and Bouhaddane, 2021; Sobreiro et al. 2023). Conversely, these changes pose challenges related to the increasing incidence of olive tree pests and diseases (Caselli and Petacchi, 2021), resulting in significant yield losses and economic consequences. Olive production in the Mediterranean regions has decreased significantly due to the emergence of biotic agents, affecting both the olive tree and the oil industry (Nuti et al., 2021). The improper use of infected olive material for vegetative propagation has facilitated the spread of systemic pathogens in olive orchards, such as viruses (Lambardi et al., 2023). To manage these threats, preventive measures such as phytosanitary selection and certification programmes have been implemented (Montilon et al., 2023). Within this context, the application of molecular diagnostic techniques for viruses detection has assumed, in the recent past, critical importance for the assessment of the sanitary status (López et al., 2009). These reliable methods are required as they are the basis for efficient and valid certification programmes, therefore research efforts focused on particular attention to the identification, diagnosis and monitoring of viral diseases affecting the olive plants in Mediterranean environment. For this aim, the present thesis, conducted as part of a three-year PhD program, delves into the investigation on viral and virus-like agents affecting olive cultivation, emphasizing the indispensable role of advanced diagnostic techniques in safeguarding olive orchards’ health and sustainability worldwide. The research effort is organised into cohesive chapters as follows. Chapter I highlighted the economic and cultural importance of olive cultivation and underlined the potential viral threats and impacts of both climate change and the implemented modern plantation systems for olive cultivation. In Chapter II, the purpose of the research work is outlined, emphasizing the importance of addressing viral diseases as a global agriculture challenge. Chapter III screened the presence of the main olive tree viruses in Sicily using the metagenomic approach based on the Oxford Nanopore MinION sequencer. The implemented diagnostic tool gave interesting preliminary results, demonstrating the potential of innovative diagnostic tools in detecting viral pathogens. Indeed, MinION technology successfully detected olea europaea geminivirus (OEGV), olive leaf yellowing-associated virus (OLYaV) and olive latent virus 3 (OLV-3) that were confirmed, subsequently, by the conventional molecular diagnostic tool end-point RT-PCR, excepting for OLV-3. For these reasons, the case study of OEGV was evaluated in Chapters IV and V, whereas OLYaV was assessed in Chapters VI and VII. In particular, the development and practical feasibility of a real-time loop-mediated isothermal amplification (LAMP) protocol for the detection and investigation of OEGV incidence in Sicily, as well as a rapid procedure for on-site preparation of olive sample were assessed and are described in Chapter IV. Moreover, with the aim of better understanding the virus transmissibility, Chapter V reported the trials that were conducted to investigate OEGV transmission via grafting using infected propagation material. As results, from one hand, the real-time LAMP assay described in this work revealed to be a potential, rapid, simple, specific and sensitive tool for the recently described OEGV detection, allowing to process of a great number of samples at the same time, especially when associated with the rapidly developed on-site sample preparation method. Moreover, the survey revealed a considerable presence of the virus within the Sicilian olive groves, probably due to the inadvertent movement of clonally propagated and asymptomatic infected germplasms. From the other hand, Preliminary results also demonstrated that OEGV was successfully transmitted through grafting, with symptoms observed within 3-7 months post-grafting. These findings emphasize the importance of rigorous screening methods and cultivar selection to mitigate virus transmission risks in olive propagation. Chapter VI focused on the development and evaluation of a real-time RT-LAMP protocol for OLYaV detection, comparing it with end-point RT-PCR assay. Moreover, the real-time RT-LAMP protocol developed was used to assess OLYaV incidence in the main olive-producing regions of Spain and Italy. Obtained results showed that the developed real-time RT-LAMP protocol for OLYaV detection was higher sensitive and specific compared to the RT-PCR end-point technique. Furthermore, the investigation conducted in the main Spanish and Italian olive-growing regions represents, to date, the first comprehensive analysis of OLYaV incidence in these territories. Actually, the virus incidence analysis showed to be highly present in the Spanish territory than in the Italian one. However, in order to provide comprehensive insights into the prevalence and distribution of the virus in Sicily, Chapter VII describes the study conducted on the dispersion of OLYaV in different Sicilian olive production sites, using the previously developed real-time RT-LAMP. The results revealed a significant prevalence of OLYaV in the sampled olive trees, with a significant number of positive samples identified in asymptomatic plants, suggesting a potential silent spread of the virus through infected propagation material or via vector insects. Ultimately, a summarized conclusive considerations and future perspectives were reported in Chapter VIII, together with all the thesis possible contributions to the advancement of knowledge in plant virology and the development of strategies that could mitigate viral threats in olive cultivation. The interesting findings in the current PhD thesis aim to significantly contribute to scientific understanding and practical application of control and prevention strategies for managing olive viral diseases. Lastly, the results of the study shed light on the current challenges facing the industry and underscore the critical role of advanced diagnostic techniques in safeguarding the health, productivity and sustainability of olive orchards.

L’olivo (Olea europaea L.) riveste un’importanza storica e socio-economica notevole, in particolare nelle regioni del Bacino del Mediterraneo (Brunori et al., 2020). La crescente domanda globale di olive da tavola e di olio d’oliva ha portato all’adozione di pratiche agricole moderne, quali la creazione di uliveti ad elevata densità e l’implementazione di sistemi di irrigazione (Mili e Bouhaddane, 2021; Sobreiro et al., 2023). Tuttavia, tali cambiamenti comportano enormi sfide legate all’incremento dell’incidenza di parassiti e malattie che colpiscono tale coltura (Caselli e Petacchi, 2021), determinando consistenti perdite di raccolto e ingenti ripercussioni economiche. In risposta, la produzione olivicola nelle regioni mediterranee ha subito una significativa diminuzione a causa dell’emergere di agenti biotici che influenzano l’industria olivicola (Nuti et al., 2021). Inoltre, l’errato impiego di materiale infetto per la propagazione vegetativa dell’olivo ha favorito la diffusione di patogeni sistemici, quali i virus (Lambardi et al., 2023). Al fine di gestire tali minacce, sono state implementate misure preventive, come programmi di selezione e certificazione fitosanitaria (Montilon et al., 2023). In questo contesto, l’applicazione delle tecniche diagnostiche molecolari per la rilevazione di tali agenti patogeni ha assunto, nel recente passato, un’importanza critica per la valutazione dello stato sanitario (López et al., 2009), rappresentando la base per efficienti e validi programmi di certificazione. Pertanto, gli sforzi di ricerca affrontati nella presente tesi, condotta nel contesto di un programma di dottorato di ricerca, si sono concentrati particolarmente sull’identificazione, diagnosi e monitoraggio delle malattie virali che colpiscono l’olivo in ambiente mediterraneo. Con tale obiettivo, la presente tesi si propone di approfondire lo studio degli agenti virali e virus-simili che influenzano la coltivazione dell’olivo, sottolineando il ruolo indispensabile delle moderne tecniche diagnostiche nel preservare la salute e la sostenibilità degli uliveti. In particolare, gli studi di ricerca affrontati sono stati organizzati in otto capitoli. Il Capitolo I evidenzia l’importanza economica e culturale della coltivazione dell’olivo, ne sottolinea le potenziali minacce virali e descrive gli impatti negativi causati sia dai cambiamenti climatici, che dai moderni sistemi di coltivazione dell’olivo. Nel Capitolo II viene descritto lo scopo del lavoro di ricerca, enfatizzando l’importanza di affrontare le malattie virali come una nuova significativasfida globale per l’olivicoltura. Nel Capitolo III viene indagata la presenza di virus che colpiscono la coltura dell’olivo in Sicilia mediante analisi metagenomiche, tramite il dispositivo MinION dell’ Oxford Nanopore. Quest’ultimo ha fornito interessanti risultati, dimostrando il potenziale delle innovative tecniche diagnostiche nel rilevare patogeni virali. Infatti, il dispositivo MinION ha rilevato con successo tre virus dell’olivo: l’olea europaea geminivirus (OEGV), l’ olive leaf yellowing-associated virus (OLYaV) e l’olive latent virus 3 (OLV-3). Tali risultati sono successivamente stati confermati mediante diagnosi molecolare attraverso l’impiego della tecnica RT-PCR end-point, ad eccezione dell’OLV-3. Pertanto, i principali virus oggetto di studio sono stati l’OEGV e l’OLYaV. In particolare, il caso studio dell’OEGV è stato valutato nei Capitoli IV e V, mentre l’OLYaV è stato valutato nei Capitoli VI e VII. In particolare, lo sviluppo e la validazione di un protocollo di real-time Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) per la rilevazione e lo studio dell’incidenza dell’OEGV in Sicilia e una procedura rapida per la preparazione in loco del campione sono stati valutati e descritti nel Capitolo IV. Inoltre, con l’obiettivo di comprendere meglio la modalità di trasmissione di OEGV, nel Capitolo V sono riportati gli esperimenti condotti per indagare la trasmissione di tale virus mediante innesto. In particolare, il protocollo real-time LAMP descritto nel Capitolo IV si è rivelato un metodo rapido, semplice, specifico e sensibile per la rilevazione dell’OEGV, consentendo di processare un gran numero di campioni contemporaneamente, specialmente quando associato al metodo rapido di preparazione del campione. Inoltre, lo studio ha rivelato una presenza considerevole del virus all’interno degli uliveti siciliani, probabilmente a causa del movimento involontario di materiale di propagazione infetto, ma asintomatico. I risultati preliminari, inoltre, hanno dimostrato che l’OEGV è stato trasmesso con successo mediante innesto e i sintomi sono stati osservati entro 3-7 mesi post-innesto. Questi risultati sottolineano l’importanza di rigorosi ed efficaci metodi di screening, al fine di mitigare i rischi di trasmissione virale. Nel Capitolo VI, invece, viene focalizzata l’attenzione sullo sviluppo e la valutazione di un protocollo real-time RT-LAMP per la rilevazione dell’OLYaV; quest’ultimo viene, inoltre, comparato con la tecnica di diagnosi RT-PCR end-point per valutarne sensibilità e specificità. Successivamente, il protocollo sviluppato è stato impiegato per valutare l’incidenza dell’OLYaV nelle principali regioni olivicole in Spagna e Italia. I risultati hanno evidenziato che il protocollo di real-time RT-LAMP per la rilevazione di OLYaV si è rivelato maggiormente sensibile e specifico rispetto alla tecnica RT-PCR end-point. Inoltre, l’indagine condotta nelle principali regioni olivicole spagnole e italiane rappresenta, ad oggi, la prima analisi completa dell’incidenza dell’OLYaV in tali territori. In particolare, l’analisi dell’incidenza del virus ha evidenziato una maggiore presenza nel territorio spagnolo rispetto a quello italiano. Tuttavia, per fornire un quadro completo sulla prevalenza e distribuzione del virus in Sicilia, nel Capitolo VII viene descritto lo studio condotto sulla diffusione dell’OLYaV in diverse provincie e siti di produzione siciliani, mediante l’utilizzo del protocollo real-time RT-LAMP precedentemente sviluppato. I risultati hanno mostrato una significativa prevalenza dell’OLYaV negli uliveti campionati, con un numero considerevole di campioni positivi identificati in piante asintomatiche, indicando una possibile diffusione silenziosa del virus attraverso il materiale di propagazione infetto o tramite insetti vettori. Infine, nel Capitolo VIII sono state esposte le conclusioni e le prospettive future, insieme a tutte le possibili implicazioni per lo sviluppo di strategie mirate a mitigare le minacce virali nella coltivazione dell’olivo. I risultati presentati nella presente tesi mirano a contribuire in modo significativo alla comprensione scientifica e all’applicazione pratica delle strategie di controllo e prevenzione per la gestione delle malattie virali dell’olivo. Infine, gli esiti degli studi condotti mettono in luce le attuali sfide che l’industria olivicola affronta e sottolineano il ruolo cruciale delle moderne tecniche diagnostiche nel proteggere la salute, la produttività e la sostenibilità degli uliveti.