Fattore anti-lps da Parietaria Judaica

L’endotossina è una tossina microbica, parte integrante della membrana esterna della parete di batteri Gram-negativi che viene rilasciata completamente con la lisi del batterio. È costituita da sub-unita’ molecolari che hanno dimensioni comprese tra 10.000 e 20.000 Daltons, mentre le aggregazioni hanno dimensioni di circa 100.000 Daltons. Un esempio tipico di endotossina è rappresentato dal lipopolisaccaride (LPS) che è presente nella membrana esterna dei batteri Gram-negativi. Le endotossine sono le principali responsabili delle conseguenze cliniche delle infezioni da batteri gram-negativi. Infatti, l’endotossina è ritenuta responsabile della patogenesi della sepsi, dello shock settico e della conseguente malattia multiorgano (MOF) (1). A causa della sua natura particolarmente aggressiva e multifattoriale, la sepsi conduce rapidamente a morte e costituisce la principale causa di decesso nelle terapie intensive non coronariche di tutto il mondo. Da qui la necessità, per la cura della sepsi, di rimuovere e/o disattivare le endotossine dal corpo del paziente prima che la malattia degeneri. Infatti, in relazione alla presenza di endotossina nel sangue si innesca una complessa attivazione immunologica che coinvolge vari sistemi biologici (immunitario e reticoloendoteliale) e una serie di mediatori, liberati principalmente dall’attivazione di macrofagi, monociti e altre cellule. Inoltre, le endotossine sono contaminanti frequenti del DNA plasmidico estratto dai batteri e di tutti quei prodotti che sono estratti e/o sono venuti a contatto con essi. Le endotossine devono essere rimosse da questi prodotti per evitare reazioni infiammatorie nel corso delle applicazioni in vivo, quali ad esempio la terapia genica. Dal punto di vista terapeutico, negli ultimi anni hanno assunto un ruolo rilevante una classe di proteine e/o peptidi (e loro derivati) che, come prodotti dell’immunità innata, sono in grado di legare e neutralizzare componenti della parete batterica tra cui l’LPS. I peptidi che sono in grado di neutralizzare questo tipo di processo vengono oggi definiti con un termine ampio quale quello di Host Defense Peptide (HDP). Quest’ultima classe di proteine sono di particolare interesse in quanto oltre all’attività antimicrobica diretta, sono in grado di potenziare la risposta immunitaria dell’organismo, promuovendo in vitro varie risposte di difesa (ad es. migrazione di leucociti, maturazione delle cellule dendritiche) e contribuendo così al potenziamento della risposta immunitaria adattativa. Queste proteine sono generalmente caratterizzate dall’avere un peso molecolare compreso tra 2 ed 80 kDa e in maniera preferenziale, contenenti amino-acidi caricati positivamente (da qui il termine di proteine cationiche) (2). Le proteine denominate non specific Lipid Transfer proteins (ns-LTPs) sono piccole molecole proteiche particolarmente stabili di approssimativamente 10 KDa solitamente presenti in tutti gli organismi vegetali sino ad oggi studiati (3). Tali proteine sono accomunate dalla capacità di promuovere, in vitro, il trasferimento di molecole lipidiche attraverso membrane anche se, studi recenti, hanno dimostrato che esse sembrano svolgere una funzione protettiva in quanto capaci di agire come peptidi ad attività antimicrobica. In alcune specie vegetali è stata dimostrata una loro capacità allergenica come nel caso delle Rosaceae Prunoideae (pesca, albicocca, prugna), Pomoideae (mela) e le Urticacee quali la Parietaria (4). La tecnologia del DNA ricombinante ha permesso l’isolamento di vari allergeni della famiglia delle proteine ns- LTPs, tra questi quelli della Parietaria denominati Parj1 e Parj2. In particolare, sono state ad oggi isolate due isoforme dell’allergene Parj1 denominate (secondo la nomenclatura internazionale) Parj1.01 e Par1.02 (5, 6). Tali isoforme differiscono essenzialmente per la presenza di una regione di 37 aminoacidi presente esclusivamente nell’isoforma Parj1.01 (7). Caratterizzazione di un peptide in grado di legare LPS batterico Una analisi in silico condotta mediante l’algoritmo messo a disposizione dall’Antimicrobial Peptide Database ha messo in evidenza che la porzione carbossiterminale del Parj1.01 presenta caratteristiche biochimiche peculiari. Tale regione presenta una carica netta totale positiva (+5) e una elevata percentuale di residui di prolina suggerendo che tale peptide possa avere la capacità di agire come peptide ad attività antimicrobica. I dati riportati in Tabella 1 descrivono la diversa capacità delle due isoforme ricombinanti dell’allergene maggiore Parj1 (Parj1.01 e Parj1.02) di legare LPS di origine batterica. I dati mostrati evidenziano come l’isoforma Parj1.01 presenti una spiccta capacità di legare LPS. Tabella 1. Saggi di determinazione della quantità di endotossina endogena Quantità di proteina analizzata Positività al LAL test rParj1.01 rParj1.02 1 μg