Design of perfusion bioreactors and PLLA-based scaffolds for in vitro tissue engineering

Tissue engineering (TE) represents a novel approach that uses cells integrated with matrices to achieve the formation of new tissues. In this strategy, three essential components constitute the so-called triad of Tissue Engineering: regulatory signals, cells, and three-dimensional (3D) biodegradable porous scaffolds. They are combined to develop an organized 3D functional tissue that mimics the extracellular matrix (ECM) of tissue to be regenerated. The tissue-specific functions of native tissues are linked to complex environments that can be replicated outside the body by using special devices called bioreactors. These systems provide an environment where specific parameters can be controlled to match desired biological conditions. In this thesis, all these components are accounted for developing in vitro models for various applications in the field of Tissue Engineering. Specifically, poly-(L-lactic acid) (PLLA)-based scaffold, scaffold fabrication via phase separation, static cell cultures, and dynamic cell cultures using perfusion bioreactors are analyzed and discussed. Two main sections compose this thesis: several experimental setups using PLLA-based scaffolds for various in vitro systems; and the design and modeling of a custom perfusion bioreactor using computational fluid dynamics (CFD) and mathematical equations. A rigorous theoretical framework is developed to study the properties of PLLA biomaterial, the use of perfusion bioreactor for regenerative medicine, and models developed for investigating cells growth on 3D matrices cultured within a dynamic system. In the experiments, the morphology of different PLLA scaffolds produced through different protocols of the thermally induced phase separation technique (TIPS) is analyzed according to the targeted properties of TE scaffolds, i.e., porosity, pore interconnectivity, and pore size. Cell cultures are performed in these constructs to create a 3D environment so that seeded cells can grow both in static 3D culture and the perfusion bioreactor. Cell proliferation and adhesion are observed up to 7 days of in vitro culture, demonstrating that scaffold morphology can induce cell growth under both static and dynamic conditions. For the second part, a combined modeling and experimental approach is followed. The custom-made perfusion apparatus is an existing airlift bioreactor that provides a low-shear environment with good mixing, resolving mass transport limitations and providing physical stimuli beneficial for overall cells proliferation and differentiation. The hydrodynamics (gas holdup, superficial liquid velocity, and shear rate) and mass transfer (kLa and the volumetric mass transfer coefficient) are modeled and determined by CFD to examine the influence of Abstract iii these features on cell and tissue growth. The simulation results indicate that the hydrodynamics matched the mathematical data and experimental validation. Then, osteoblast cells are cultured on a support in the bioreactor perfused with culture medium at 10mL/min for up to 6 days. An evaluation combining proliferation results and statistical analysis allows the quantification of cell growth as a function of the space inside the system. Given the hierarchical nature of the bioreactor-scaffold system, its multi-scale nature will be considered, ranging from the extracellular matrix scale to the bioreactor scale. The flow-dependent properties of an engineered matrix cultured within a perfusion bioreactor are studied theoretically and evaluated experimentally, emphasizing the influence of inter-scale dependencies. Perfusion bioreactors are in vitro systems beneficial for drug screening because they mimic the in vivo environment. For this purpose, an optimized design of the airlift bioreactor that can induce a double-flow on a hollow scaffold is theoretically and experimentally validated. Specifically, the system is tested for carriers diffusion and air-liquid-interface (ALI) model to reproduce the nasal mucosa environment. The rationale is to combine an internal and an external flow of independent fluids for either diffusing the carriers throughout the engineered matrix for drug prescreening or redirecting the culture medium to feed the cells seeded into the channel of the hollow scaffold. In conclusion, this thesis project focuses on the major aspects of tissue engineering and regenerative medicine, varying from in vitro tests for growing cells on scaffolds toward models to study the multi-scale nature of a tissue-like system or recreate the physiology of a native tissue.

L'ingegneria tissutale rappresenta un nuovo approccio che integra cellule e matrici ingegnerizzate per la formazione di nuovi tessuti. In questa strategia, tre componenti essenziali costituiscono la cosiddetta triade della Tissue Engineering: segnali regolatori, cellule e scaffold tridimensionali (3D) biodegradabili e porosi. Tali elementi sono combinati per sviluppare un tessuto funzionale organizzato e 3D che simula la matrice extracellulare (ECM) del tessuto da rigenerare. Le funzioni specifiche dei tessuti nativi sono correlate agli ambienti complessi che, all'esterno del corpo, possono essere imitati usando degli strumenti chiamati bioreattori. Questi sistemi forniscono un ambiente in cui i parametri specifici possono essere controllati per raggiungere le condizioni biologiche desiderate. In questa tesi, tutti questi componenti sono stati impiegati per lo sviluppo di modelli in vitro in diverse applicazioni dell'ingegneria tissutale. In particolare, sono stati analizzati e discussi i temi relativi a: scaffold a base di poli-(acido L-lattico) (PLLA), fabbricazione di scaffold tramite separazione di fase, colture cellulari statiche e colture cellulari dinamiche utilizzando bioreattori di perfusione. Due sezioni principali compongono questa tesi: diverse configurazioni sperimentali che utilizzano scaffold a base di PLLA per vari sistemi in vitro; e la progettazione e la modellazione di un bioreattore di perfusione utilizzando fluidodinamica computazionale (CFD) ed equazioni matematiche. In primis, un rigoroso quadro teorico è stato investigato per studiare le proprietà del biomateriale PLLA, l'uso di bioreattori a perfusione per la medicina rigenerativa e i modelli sviluppati per studiare la crescita delle cellule su matrici 3D coltivate all'interno di un sistema dinamico. Negli esperimenti, la morfologia di diversi scaffold in PLLA prodotti attraverso vari protocolli della tecnica di separazione di fase indotta termicamente (TIPS) è stata analizzata in base alle proprietà desiderate per scaffold adatti agli scopi dell’ingegneria tissutale, in termini di porosità, interconnessione dei pori e dimensione dei pori. Le colture cellulari sono state eseguite in questi costrutti per creare un ambiente 3D in modo che le cellule seminate potessero crescere sia in coltura statica 3D che nel bioreattore a perfusione. La proliferazione e l'adesione delle cellule sono state osservate fino a 7 giorni di coltura in vitro, dimostrando che la morfologia degli scaffold può indurre la crescita delle cellule sia in condizioni statiche che dinamiche. Per la seconda parte, si è seguito un approccio combinato di modellazione e sperimentazione. Il sistema di perfusione usato è un bioreattore airlift (precedentemente progettato dal mio gruppo di ricerca) che fornisce un ambiente a basso sforzo di taglio e una buona miscelazione, risolvendo i limiti del trasporto di massa e fornendo stimoli fisici Sommario v vantaggiosi per la proliferazione e la differenziazione delle cellule. L'idrodinamica (gas holdup, velocità superficiale del liquido e sforzo di taglio) e il trasferimento di massa (in termini di coefficiente di trasferimento di massa) sono stati modellati e determinati da analisi CFD per esaminare l'influenza di questi parametri sulla crescita delle cellule e dei tessuti. I risultati della simulazione hanno indicato che l'idrodinamica, i dati matematici e la validazione sperimentale erano in linea tra di loro. In seguito, cellule osteoblastiche sono state coltivate su scaffold posti su un supporto all’interno del bioreattore perfuso con terreno di coltura a 10ml/ min per un massimo di 6 giorni. Combinando i risultati della proliferazione e l'analisi statistica, è stata quantificata e analizzata la crescita cellulare in funzione dello spazio all'interno del sistema bioreattore. Data la natura gerarchica del sistema bioreattore-scaffold, tale sistema è stato considerato dalla scala della matrice extracellulare alla scala del bioreattore. Le proprietà dipendenti dal flusso di una matrice ingegnerizzata e coltivata all'interno di un bioreattore a perfusione sono state studiate teoricamente e valutate sperimentalmente, sottolineando l'influenza delle dipendenze inter-scala. I bioreattori a perfusione sono sistemi in vitro utili per testare famaci poiché imitano l'ambiente in vivo. A questo scopo, è stato modellato e validato sperimentalmente un sistema ottimizzato del bioreattore airlift in grado di indurre un doppio flusso su uno scaffold fabbricato con un canale al suo interno. In particolare, il sistema è stato testato per la diffusione di carriers e per simulare un sistema aria-liquido-interfaccia (ALI) tale da riprodurre l'ambiente della mucosa nasale. Il razionale di tale sistema è il potenziale legato alla combinazione di un flusso interno ed uno esterno di fluidi indipendenti al fine di diffondere i carriers in tutta la matrice ingegnerizzata per pre-screening di farmaci o reindirizzare il mezzo di coltura nel canale dello scaffold per alimentare le cellule seminate. In conclusione, questo progetto di tesi si è concentrato sui principali aspetti dell'ingegneria tissutale e della medicina rigenerativa, spaziando da test in vitro per la crescita delle cellule su scaffold, a modelli per studiare sia le caratteristiche multi-scala di un sistema atto a replicare un tessuto sia l'efficacia della fluidodinamica di un sistema nuovo destinato a validare test farmacologici o mimare al meglio la fisiologia di un tessuto.