COINVOLGIMENTO DELLO STRESS DEL RETICOLO E DEL PROCESSO AUTOFAGICO NELL’APOPTOSI INDOTTA DAL CANNABINOIDE SINTETICO WIN IN CELLULE DI EPATOMA UMANO IN COLTURA

Studi da noi condotti precedentemente hanno dimostrato la capacità del cannabinoide sintetico WIN di indurre apoptosi in cellule di epatocarcinoma umano HepG2 attraverso un meccanismo, dipendente dal fattore trascrizionale PPARg, che prevede riduzione dei livelli di alcuni fattori di sopravvivenza e attivazione di fattori pro-apoptotici della famiglia Bcl-2 (M. Giuliano et al. Biochimie. 2009). Recentemente è, inoltre, emerso che in cellule di glioma i cannabinoidi possono stimolare l’apoptosi attraverso induzione di stress del reticolo endoplasmatico seguito da autofagia. Scopo L'obiettivo del presente studio è stato quello di valutare il coinvolgimento dell’autofagia nel percorso di morte indotto dal WIN in cellule HepG2 e la dipendenza dell’apoptosi da tale evento. Metodi I livelli dei fattori coinvolti nella risposta all’ER stress e nel meccanismo autofagico sono stati analizzati mediante Western blotting e RT-PCR. La formazione dei vacuoli autofagici è stata valutata marcando le cellule con il composto autofluorescente monodansylcadaverina (MDC) e successiva osservazione al microscopio a fluorescenza. Risultati Il trattamento delle cellule HepG2 con 10 mM WIN determina, già a tempi precoci (8-16 ore), up-regulation di p8 e CHOP, due fattori con attività pro-apoptotica associati alla risposta allo stress del reticolo. Parallelamente, WIN induce la marcata caduta dei livelli di AKT e della sua forma fosforilata attiva. Poichè è noto che l’inibizione di AKT può promuovere l’autofagia causata dalla mancata attivazione di mTORC1 AKT-dipendente, abbiamo investigato la formazione dei vacuoli autofagici. WIN determina in cellule HepG2, dopo 8 ore di trattamento, la comparsa di un elevato numero di vacuoli autofagici, visibili come granuli brillanti dopo colorazione con MDC. Parallelamente si osserva, dopo trattamento, un marcato incremento nei livelli della forma lipidata attiva di LC3 (LC3-II), un marker della formazione dell’autofagosoma. Per confermare la relazione tra induzione dell’ER stress, autofagia e apoptosi WIN-dipendente, sono stati condotti esperimenti di silenziamento genico su CHOP. Tali studi hanno indicato che la down-regulation di CHOP contrasta la riduzione dei livelli di AKT e parallelamente la citotossicità indotta dal WIN. Conclusioni I risultati riportati, sebbene preliminari, sembrano indicare che l’autofagia sia parte del meccanismo attraverso il quale WIN induce apoptosi nelle cellule di epatoma.