The Exosomes-derived EGFR Ligand Amphiregulin (AREG) is a new key player in Multiple Myeloma Bone Destruction

Background: Multiple myeloma (MM) is a clonal plasma cell malignancy associated with osteolytic bone disease. Recently, the role of MM-derived exosomes in the osteoclastogenesis has been demonstrated although the underlying mechanism is still unknown. Since exosomes-derived epidermal growth factor receptor ligands (EGFR) are involved in tumor-associated osteolysis, we hypothesize that the EGFR ligand Amphiregulin (AREG) can be delivered by MM-derived exosomes and participate in MM-induced osteoclastogenesis. Methods: Exosomes were isolated from the conditioned medium of MM1.S cell line and from bone marrow (BM) plasma samples of MM patients. The murine cell line RAW264.7 and primary human CD14+ cells were used as osteoclast (OCs) sources. Results: We found that AREG was specifically enriched in exosomes from MM samples and that exosomes-derived AREG led to the activation of EGFR in pre-OCs, as showed by the increase of mRNA expression of the downstream target SNAIL in both RAW264.7 and CD14+ cells. The presence of neutralizing anti-AREG monoclonal antibody (mAb) reverted this effect. Consequently, we showed that the effect of MM-derived exosomes on osteoclast differentiation was inhibited by the pre-treatment of exosomes with anti-AREG mAb. In addition, we demonstrated the ability of MM-derived AREG-enriched exosomes to be internalized human mesenchymal stromal cells (MSCs) thus blocking osteoblast differentiation, increasing MM cell adhesion and the release of the pro-osteoclastogenic cytokine interleukin-8. Accordingly, anti-AREG mAb inhibited the release of interleukin-8 by MSCs suggesting that both direct and indirect effects are responsible for AREG-enriched exosomes involvement on MM-induced osteoclastogenesis. Conclusions: In conclusion, our data indicate that AREG is packed into MM-derived exosomes and implicated in OCs differentiation through an indirect mechanism mediated by osteoblasts.

Il Mieloma Multiplo (MM) è caratterizzato dalla presenza di aree osteolitiche dovute alla presenza di plasmacellule (PC) neoplastiche che causano l'interruzione della normale omeostasi ossea, promuovendo l'attività degli osteoclasti (OC) ed inibendo la funzione degli (OB). Al momento, uno dei campi di ricerca nella fisiopatologia del MM è proprio lo studio dei meccanismi che regolano l’attività degli OC e degli OB così come l’identificazione di target terapeutici per la prevenzione ed il trattamento delle lesioni osteolitiche. Negli ultimi anni è emerso che le vescicole extracellulari (EV), ed in particolare gli esosomi, giocano un ruolo fondamentale nel mediare il cross-talk tra le cellule tumorali ed il microambiente. Gli esosomi sono microvescicole aventi un diametro di 40-100 nm di origine endocitica che sono rilasciate nell’ambiente extracellulare da diversi tipi cellulari in condizioni sia fisiologiche che patologiche. Nel MM mediano la comunicazione cellula-cellula tra le plasma cellule e le cellule stromali midollari, influenzando la crescita e la sopravvivenza tumorale, l’apoptosi, l’invasione, l’angiogenesi e la resistenza ai farmaci. Inoltre, dati in letteratura dimostrano che gli esosomi isolati da cellule di MM sono coinvolti nel differenziamento degli OC. The epidermal growth factor receptor (EGFR) è una glicoproteina transmembrana con un’intriseca attività tirosin chinasica, stimolata da diversi fattori di crescita quali amphiregulina (AREG) betacellulina (BTC), fattore di crescita epidermico (EGF), epigen (EPGN), epiregulina (EREG), il fattore di crescita EGF-simile legante l'eparina (HBEGF) e il fattore di crescita trasformante α (TGF-α). Il pathway di EGFR agisce a livello di diversi processi fisiologici cellulari avendo così degli effetti pleiotropici su proliferazione, differenziazione e motilità. Dati di letteratura dimostrano che l’asse EGFR- EGFR ligands stimola la proliferazione dei precursori osteoclastici e dei precursori osteoblastici, inibendo la differenziazione di quest’ultimi in vitro. Zhu et al. riportano che EGF-like ligands stimolano l’osteoclastogenesi attraverso l’attivazione degli OC. Scopo del presente studio è stato quello di valutare il coinvolgimento dell’asse EGFR-EGFR ligands nella malattia ossea indotta da MM ed in particolare valutare la presenza dei ligandi di EGFR all'interno degli esosomi. Per prima cosa abbiamo isolato gli esosomi rilasciati da una linea cellulare di MM (MM1.s) e dal plasma midollare di 4 pazienti affetti da MM attivo mediante protocollo di ultracentrifugazione. Abbiamo visto che gli esosomi isolati dalle MM1.s e da 3 pazienti su 4 risultano arricchiti della proteina AREG, che sembra invece poco presente nel mezzo condizionato delle cellule deprivato di esosomi. Il risultato supporta l’ipotesi che AREG possa essere rilasciato dalle cellule per mezzo degli esosomi. Il modello sperimentale utilizzato è costituito da due linee cellulari: le RAW 264.7 (cellule murine macrofagiche, precursori degli osteoclasti) e monociti CD14+ isolati, tramite metodo immunomagnetico, da buffy-coat di sangue periferico di donatori sani. Per dimostrare il coinvolgimento degli esosomi rilasciati dalle cellule di MM nell’induzione dell’osteoclastogenesi attraverso l’attivazione di EGFR pathway, abbiamo valutato attraverso RT-PCR i livelli di espressione di SNAIL, un fattore di trascrizione dipendente dall’attivazione di EGFR, nelle RAW 264.7 e CD14+ trattati con esosomi isolati dalle cellule di MM ed esosomi pre-trattati con anticorpo neutralizzante anti-AREG. Abbiamo dimostrato che i livelli di espressione di SNAIL aumentano in seguito a trattamento con gli esosomi di mieloma mentre tale effetto è parzialmente revertito dopo pre-trattamento con anticorpo neutralizzante anti-AREG. Nello stesso setting sperimentale abbiamo valutato mediante RT-PCR i marker di differenziamento osteoclastico. Il trattamento con esosomi induce, sia a livello di mRNA che a livello proteico, un aumento dei markers di osteoclastogenesi come MMP9, Cathepsin K e TRAP. Anche questi risultati dimostrano che gli esosomi isolati da pazienti affetti da MM inducono un effetto pro-osteoclastogenico ma tale effetto viene revertito in seguito al pretrattamento degli esosomi con anticorpo neutralizzante anti-AREG. Inoltre abbiamo validato il potenziale ruolo dell’asse EGFR/EGFR ligands nella formazione di OC, tramite esperimenti di osteoclastogenesi in vitro a partire sia da RAW 264.7 che da CD14+ in presenza di esosomi isolati dalle cellule di MM ed esosomi pre-trattati con anticorpo neutralizzante anti-AREG. La presenza di esosomi induce un maggior differenziamento osteoclastico rispetto alle cellule non trattate e rispetto alle cellule trattate con l’anticorpo neutralizzante anti-AREG. In seguito abbiamo valutato gli effetti degli esosomi su cellule mesenchimali (MSC). E’ stato visto che gli esosomi isolati dalle cellule di MM vengono internalizzati dalle MSC indipendentemente dalla presenza dell’anticorpo neutralizzante AREG, inibiscono la differenziazione osteoblastica, aumentano l’adesione delle cellule di MM e inducono il rilascio di citochine pro-osteoclastogeniche come IL-8 da parte delle MSC. L’inibizione della produzione di IL-8 dopo il trattamento con l’anticorpo neutralizzante anti-AREG suggerisce che gli esosomi isolati dalle cellule di MM e arricchiti della proteina AREG inducono l’osteoclastogenesi, sia attraverso un meccanismo diretto sugli OC che attraverso uno indiretto mediato dalle MSC. In conclusione, i nostri dati indicano che gli esosomi isolati dalle cellule di MM e arricchiti della proteina AREG giocano un ruolo nell’osteoclastogenesi MM indotta attraverso l’attivazione del pathway di EGFR.