An integrated Tissue Engineering approach to Human Bronchial model: Biodegradable Scaffold and Microfluidics Platform

Montesanto, S

Tissue engineering is the use of a combination of cells, engineering and materials methods, together with suitable biochemical and physical-chemical factors to improve or replace biological functions of damage/deficient tissues [1, 2]. With this respect polymeric porous structures and microfluidics systems are used for tissue engineering purposes. Biodegradable polymeric scaffolds have been harnessed as temporal structural supports to regenerate various tissues such as bone, cartilage, nerve, ligament, skin and liver. An open porous geometry with interconnected channels is a prerequisite for high density cell growth as well as for a sustained mass transport of nutrients, oxygen, and metabolic waste; as a matter of fact, a high cell density and efficient mass transport contribute to cell viability, proliferation, and ultimate rehabilitation into functional tissues [3-5]. A wide range of biodegradable scaffolds with different morphologies have been fabricated by conventional methods such as solid porogen leaching, gas foaming, emulsion/ freeze drying, expansion in supercritical fluid and phase separation techniques [6,7]. The most widely adopted phase separation techniques are known with the acronyms TIPS (thermally induced phase separation) and DIPS (diffusion induced phase separation). More specifically, the production of polymeric scaffolds and membranes via DIPS has been widely studied and applied for a number of model systems. Various researchers investigated systematically the structure, porosity and crystallization behaviour of poly(L-lactic acid), blend of poly(L-lactic acid)/polyurethane and poly(L-lactic acid)/ polycaprolactone triol membranes, prepared from ethanol/dioxane and ethanol/water coagulation baths via phase separation [8-11], finding interesting correlations between phase behaviour, kinetics of demixing and the resulting membrane morphology. Other authors showed that mechanical properties of foams are mainly controlled by the gas pressure, material properties, manufacturing methods, and cell geometry. With this respect, the geometrical features influencing the mechanical properties were determined: number of open cells, relative foam density, cell size and cell shape [12,13]. A well designed tissue engineering scaffold should provide initial support to the seeded cells, localise the cells in the appropriate spaces, and provide physical and biological cues for adhesion, migration, proliferation, differentiation and eventually formation of model tissues and organs [14-16]. Microfluidic cell culture platforms combine the advantages of miniaturization and real-time microscopic observation with the ability to pattern cell culture substrates [17] to vary the composition of culture medium over space using gradient generators [18], and to create cell culture conditions that are more physiological than those found in other in vitro systems, in terms of nutrients exchange rates and to unable mechanical stimulation [19]. Microfluidic systems can be used as platforms to control and run cell and tissue growth analysis. In this thesis, the attention is focused on the DIPS process, commonly used for the production of membranes for various applications and scaffolds for tissue engineering purposes. The target system selected in this work is constituted by poly-L-lactic acid (PLLA), dioxane and water. This ternary solution was adopted for the production of both thin membranes scaffolds for tissue engineering and biodegradable mechanical support. As a first step to the characterization of the system PLLA-dioxane-water, sets of experimental parameters were characterized to obtain skinless membrane. A particular attention was paid to coagulation bath concentration, coagulation bath number, immersion time and drying environment. SEM, DSC and DMA analysis were used to characterize the series of thin membranes obtained changing experimental parameters. The results are in line with those available in literature for similar systems. As a second step to the application of thin membranes is based on human cellular models realization for tissue engineering. Two kinds of human model were employed: the cellular model by NCI-H441 and A549. The experimental campaign was mainly dedicated to evaluate and compared the models realized on PLLA thin membranes than models realized on standard polyester (PE) membrane. Immunocytochemical, TEER (TransEpithelial Electrical Resistance) and ELISA were used to evaluate the results obtained. As a third step to the application of thin membranes is based on design and development of a microfluidic devices in which the membranes are integrated. Soft lithography technique is used to build silica mold and electrical characterization technique was development to monitoring the tissue growth. A549 cell was used to set up the most important experimental parameters. The results are in line with those available in literature for similar systems. The last thin membranes application is based on method of coating humans or/and animals decellularized biological tissues with poly-L-lactic acid (PLLA) for the preparation of a natural/synthetic hybrid tissues. Poly-L-lactic acid is a biodegradable, biocompatible, bioresorbable polymer whose degradation product is lactic acid via lactacid anaerobic metabolism. Decellularized tissue is coated with poly-L-lactic acid and foamed. The proposed technological method allows: the realization of a natural/synthetic three-dimensional scaffold capable of supporting growth and differentiation of the cells implanted; the upswing of mechanical property of the biological tissue lost during the decellularization process; the mechanical support to improve and make easy the transplant of the bioengineered tissues; the protection against external environment to keep a aseptic environment when the tissue is exposed to outdoor environments.

L’ingegneria tissutale è la combinazione di cellule, materiali e metodi di ingegneria, insieme con opportuni fattori biochimici e fisico-chimici, volta a migliorare o sostituire le funzioni biologiche di tessuti danneggiati [1, 2]. A tal proposito supporti porosi e sistemi microfluidici sono utilizzati per scopi di ingegneria tissutale. Scaffold polimerici biodegradabili sono stati sfruttati come supporti strutturali per rigenerare vari tessuti quali ossa, cartilagini, nervi, legamenti, pelle e fegato. Una geometria porosa aperta con canali interconnessi è un prerequisito per la crescita cellulare ad alta densità e per un trasporto di nutrienti, ossigeno e prodotti di scarto metabolici. Infatti, una elevata densità cellulare e un efficiente trasporto di massa contribuiscono alla vitalità cellulare, alla proliferazione e alla riabilitazione finale nei tessuti funzionali [3-5]. Una vasta gamma di scaffold biodegradabili con diverse morfologie è stata fabbricata con metodi convenzionali quali lisciviazione di un porogen solido, schiumatura gas, emulsione/ liofilizzazione, espansione di fluido supercritico e tecniche di separazione di fase [6,7]. Le tecniche di separazione di fase più ampiamente adottate sono note con l’acronimo TIPS (Thermally Induced Phase Separation) e DIPS (Diffusion Induced Phase Separation). Più in particolare, la produzione di supporti polimerici e membrane tramite DIPS è stata ampiamente studiata e applicata per un certo numero di sistemi modello. Vari ricercatori hanno studiato sistematicamente la struttura, la porosità e la cristallizzazione del poli (acido L-lattico), miscela di poli (acido L-lattico) / poliuretano e poli (acido L-lattico) / policaprolattone membrane triolo, preparati da etanolo / diossano e bagni di etanolo / acqua coagulazione attraverso la separazione di fase [8-11], trovando interessanti correlazioni tra il comportamento di fase, la cinetica di demixing e la morfologia della membrana risultante. Altri autori hanno dimostrato che le proprietà meccaniche delle schiume sono controllate principalmente dalla pressione del gas, dalle proprietà dei materiali, dai metodi di fabbricazione e dalla geometria della cella. Con questo proposito, sono state determinate le caratteristiche geometriche che influenzano le proprietà meccaniche: numero di cellule aperte, densità relativa, dimensione delle celle e forma delle cellule [12,13]. Affinché uno scaffold sia idoneo per applicazioni di ingegneria tissutale deve fornire: supporto iniziale e localizzazione delle cellule seminate negli appositi spazi, spunti fisici e biologici per l'adesione, migrazione, proliferazione, differenziazione e, infine, la formazione di tessuti e organi [14-16] . Dispositivi di coltura cellulare microfluidici combinano i vantaggi di miniaturizzazione, semplicità di gestione e di osservazione microscopica (in tempo reale). La microfluidica fornisce la possibilità di variare la composizione del terreno di coltura usando generatori di gradiente [17, 18] al fine di creare condizioni di coltura cellulare che sono fisiologicamente più vicine rispetto ai tradizionali sistemi in vitro (velocità di scambio sostanze nutritive, capacità di stimolazioni meccaniche) [19]. I sistemi microfluidici possono essere utilizzati come piattaforme per controllare e gestire analisi di crescita cellulare e del tessuto. In questa tesi, l'attenzione è focalizzata sul processo DIPS, comunemente utilizzato per la produzione di membrane per varie applicazioni e di scaffold per scopi di ingegneria tissutale. Il sistema selezionato in questo lavoro è costituito da acido poli-L-lattico (PLLA), diossano e acqua. Questa soluzione ternaria è stata usata per la produzione di membrane sottili da usare sia come scaffold per l'ingegneria tissutale che come supporto meccanico biodegradabile. La presente tesi è articolata in più fasi. Come primo passo per la caratterizzazione del sistema PLLA-diossano-acqua, un set di parametri sperimentali sono stati caratterizzati al fine di ottenere membrane porose su entrambi le superfici. Una particolare attenzione è stata dedicata alla concentrazione e al numero dei bagni di coagulazione, al tempo di immersione per singolo bagno e all'ambiente di essiccazione. Analisi SEM, DSC e DMA sono state realizzate per caratterizzare la serie di membrane ottenute modificando parametri sperimentali. I risultati sono in linea con quelli disponibili in letteratura per sistemi simili. La seconda fase di questo lavoro, che punta all'applicazione delle membrane sottili, si basa sulla realizzazione di modelli cellulari umani per l'ingegneria tissutale. Due modelli umani sono stati riprodotti: il modello cellulare da NCI-H441 o A549 e il modello di outgrowth da biopsia umana. I due diversi percorsi seguiti in questo lavoro, vale a dire l'indagine sperimentale del modello cellulare e del modello outgrowth sulle membrane di PLLA, sono complementari. La campagna sperimentale è stata principalmente dedicata a valutare e confrontare i modelli realizzati su membrane sottili di PLLA rispetto ai modelli realizzati su membrane standard di polietilene (PE). Analisi di immunocitochimica, TEER (TransEpiteliale Electrical Resistance) ed ELISA sono state impiegate per valutare i risultati ottenuti. Il terzo passo per l'applicazione delle membrane sottili si basa sulla progettazione e sullo sviluppo di dispositivi microfluidici in cui le membrane sono integrate. Tecniche di soft- litografia sono state utilizzate per costruire lo stampo di silicio per la fabbricazione del dispositivo microfluidico. Successivamente sono state sviluppate tecniche di caratterizzazione elettrica per il monitoraggio della crescita dei tessuti. Colture cellulari di A549 sono state utilizzate per settare i principali parametri sperimentali. I risultati sono in linea con quelli disponibili in letteratura per sistemi simili. L'ultima applicazione delle membrane riprodotte in questo lavoro di tesi si basa sul rivestimento di tessuti biologici umani e/o animale per la preparazione di un tessuto ibrido naturale/ sintetico. Il PLLA (Acido Poli-L-lattico) è un polimero biodegradabile, biocompatibile e bioassorbibile il cui prodotto di degradazione è l'acido lattico, ottenuto dal metabolismo anaerobico lattacido. I tessuti decellularizzati (trachee suine) sono state rivestite con membrane di PLLA e testati meccanicamente. Il metodo tecnologico proposto permette: la realizzazione di uno scaffold sintetico-naturali-tridimensionale in grado di sostenere la crescita e la differenziazione delle cellule impiantate; la ripresa delle proprietà meccaniche del tessuto biologico perse durante il processo di decellularizzazione; il supporto meccanico per migliorare e rendere facile il trapianto di tessuti biotecnologici; la protezione contro l’ambiente esterno al fine di mantenere un ambiente asettico quando il tessuto è esposto ad ambienti esterni.

Montesanto, S.An integrated Tissue Engineering approach to Human Bronchial model: Biodegradable Scaffold and Microfluidics Platform.