STRATEGIE DI DIREZIONAMENTO ALL’EPATOCARCINOMA DI FARMACI ANTITUMORALI MEDIANTE SISTEMI NANOPARTICELLARI E DI VISUALIZZAZIONE IN CELLULE TUMORALI DELLA PROTEINA DI TRASLOCAZIONE MITOCONDRIALE TSPO.

The purpose of the present work was to provide new nanoparticles for the delivery of drugs or imaging agents, potentially useful for the therapy and/or for diagnosis of hepatocellular carcinoma (HCC), in particular for those forms characterized by overexpression of asialoglycoprotein receptor (ASGP-R) or of Translocator Protein mitochondrial receptor TSPO. In particular, in Chapter 2 are reported the synthesis, the physical-chemical characterization, the cellular internalization ability and the antitumor efficacy of a new nanoparticle system, consisting of a poly-amido-amine dendrimer (PAMAM), suitably functionalized with lactobionic acid for the selective recognition of the ASGP-R receptor and labeled with fluorescein isothiocyanate, able to convey in the hydrophobic core, the drug Sorafenib, currently used in most of the 'HCC therapy. As shown by cytotoxicity assays, recovery and annexin V, conducted on two human liver cancer cell lines (HepG-2 and HLE), sorafenib included in the dendrimer, does not lose its effectiveness, on the contrary, is able to produce a more lasting effect over time compared to sorafenib administered alone. In addition, as expected, there was an increase in the solubility of sorafenib included in the dendrimer. These results allow to consider this new dendrimer ASGP-R-targeted, as a nanovector suitable for the selective release of sorafenib in the cytoplasm of liver cancer cells overexpressing this receptor. In Chapter 3 is reported a new nanoformulations represented by phospholipid micelles modified with polyethylene glycol and loaded with SPIONs and sorafenib. They have been carefully prepared and characterized by means of complementary techniques. The nanocarriers resulted effective for drug delivery, with a good stability in an aqueous environment and a suitable drug loading. It was also carried out an analysis of the obtained magnetic structures, which allowed to determine the correct amount of SPIONs to be incorporated in the micelles. An in vitro system has been specifically designed and produced to show that the micelles incorporating SPIONs were effectively retained by the magnetic field generated by the system under the conditions typically found in the human liver flow. The experiments conducted on liver cancer cell lines (HepG-2) have shown that this new delivery nanoplatform of drug, is able to improve the antitumor efficacy of the drug when magnetically directed. These magnetic nanovectors therefore represent promising candidates for targeting of specific hepatic tumor sites, where the selective release of sorafenib is able to improve its efficacy and safety profile. In chapters 4 and 5 are instead described two new nanoparticellar systems, able to selectively bind the mitochondrial receptor TSPO and potentially useful for the in vitro imaging of this receptor. Mitochondria represent an subcellular interesting target, given the innumerable functions performed by this organelle to ensure cell viability, such as the calcium metabolism, the control of oxidative stress, and the regulation of apoptotic processes. However, the mitochondrial targeting has been a neglected area so far. In particular the system described in chapter 4 consists of a PAMAM dendrimer of fourth generation, functionalized with an highly affine selective ligand of TSPO with a structure 2-phenyl-imidazo [1,2-a] piridinacetammidica synthesized in our laboratories, and fluorescein isothiocyanate (FITC) as an organic fluorophore. These new nano-platforms have unique characteristics, in fact, are prepared with a level of control not achievable with most of the linear polymers, leading to globular macromolecules almost monodisperse, with a large number of peripheral groups. Consequently, they represent an ideal candidate as a nanovector for the delivery, and to study the effects of the polymer size, charge, composition and architecture, on the biologically relevant properties such as interactions with the lipid bilayer, cytotoxicity, cell internalization and interactions with subcellular compartments and organelles. The cellular uptake studies conducted on cells overexpressing the receptor TSPO (C6 rat glioma cells), also under the influence of specific inhibitors of endocytosis, by cell fractionation experiments and analysis of co-localization (by microscopy CAT (Confocale- AFM-TIRF)), have shown that this new nanosystem is rapidly internalized into the cells and especially is able to target selectively the mitochondria. Furthermore, the limitations attributable to the use of FITC as organic fluorophore, have been overcome with the realization of a new hybrid nanostructure, thoroughly described in chapter 5, based on fluorescent QDs suitably functionalized for the recognition of TSPO receptor, with the same highly affine and selective ligand used for the dendrimer described in the previous chapter. In particular, the rational design of QDs nanoparticles (QD@SiO2NPs) coated with amino-functionalized silica, has allowed the development of a versatile nanoplatform for the functionalization with the TSPO ligand. The colloidal stability and the optical properties of this new nanomaterial have been carefully evaluated. The cell fractionation experiments and confocal microscopy analysis conducted on C6 cells overexpressing the receptor, confirmed the great potential of this multifunctional nanosystem as a selective agent for mitochondrial imaging in vitro.

Lo scopo di questo lavoro di tesi è stato quello di realizzare nuovi sistemi nanoparticellari per il direzionamento di farmaci o di agenti per l’imaging, potenzialmente utilizzabili per la terapia e/o per la diagnosi dell’epatocarcinoma (HCC), in particolare per quelle forme caratterizzate dall’overespressione del recettore di membrana degli epatociti ASGP-R o del recettore mitocondriale TSPO. In particolare, nel capitolo 2 sono state descritte la sintesi, la caratterizzazione chimico fisica, la capacità di internalizzazione cellulare e l’efficacia antitumorale di un nuovo sistema nanoparticellare, costituito da un dendrimero a struttura poli-amido-aminica (PAMAM) di quarta generazione, opportunamente funzionalizzato con acido lactobionico per il riconoscimento selettivo del recettore ASGP-R e marcato con fluoresceina isotiocianato, in grado di veicolare nel core idrofobico, il farmaco attualmente più utilizzato nella terapia dell’ HCC, il Sorafenib. Come evidenziato dai saggi di citotossicità, di recovery ed annexina V, condotti su due linee cellulari di tumore epatico umane (HepG-2 ed HLE), il sorafenib incluso nel dendrimero, non perde la sua efficacia, al contrario, è in grado di produrre un effetto più duraturo nel tempo rispetto al sorafenib somministrato tal quale. In aggiunta, come prevedibile, si è registrato un aumento della solubilità del sorafenib incluso nel dendrimero. Questi risultati consentono di considerare questo nuovo dendrimero ASGP-R-direzionato, come un vettore adatto per il rilascio selettivo di sorafenib nel citoplasma delle cellule di cancro al fegato overesprimenti tale recettore. Nel capitolo 3 sono state descritte delle nuove nanoformulazioni rappresentate da micelle fosfolipidiche modificate con polietilenglicole e caricate con SPIONs e sorafenib. Esse sono state accuratamente preparate e caratterizzate mediante tecniche complementari, risultando dei nanovettori efficaci per il drug delivery, con una buona stabilità in ambiente acquoso ed un opportuno carico di farmaco. È stata effettuata anche un’analisi magnetica delle strutture ottenute, che ha permesso di determinare la giusta quantità di SPIONs da incorporare nelle micelle. È stato specificamente progettato e realizzato un sistema in vitro per dimostrare che le micelle inglobanti le SPIONs erano efficacemente trattenute dal campo magnetico generato dal sistema nelle condizioni di flusso tipicamente presenti nel fegato umano. Gli esperimenti condotti su linee cellulari di tumore epatico (HepG-2) hanno dimostrato che questa nuova piattaforma di distribuzione del farmaco, è in grado di migliorare l'efficacia antitumorale del farmaco quando magneticamente direzionato. I suddetti nanovettori magnetici rappresentano pertanto dei candidati promettenti per il direzionamento verso specifici siti di tumore epatico, dove il rilascio selettivo di sorafenib risulta in grado di migliorare il suo profilo di efficacia e sicurezza. Nei capitoli 4 e 5 sono stati invece descritti due nuovi sistemi nanoparticellari, in grado di legare selettivamente il recettore mitocondriale TSPO e potenzialmente utilizzabili per l’imaging in vitro di tale recettore. I mitocondri rappresentano un bersaglio subcellulare interessante date le innumerevoli funzioni svolte per garantire la vitalità cellulare, quali ad esempio il metabolismo del calcio, controllo dello stress ossidativo, e la regolazione dei processi apoptotici. Tuttavia, il targeting mitocondriale è stato un settore trascurato finora. In particolare il sistema descritto nel capitolo 4 è costituito da un dendrimero PAMAM di quarta generazione, funzionalizzato con un ligando altamente affine e selettivo per il, suddetto recettore a struttura 2-fenil-imidazo[1,2-a]piridinacetammidica sintetizzato nei nostri laboratori, e con fluoresceina isotiocianato (FITC) come fluoroforo organico. Queste nuove nano-piattaforme hanno caratteristiche uniche, infatti, vengono preparati con un livello di controllo non raggiungibile con la maggior parte dei polimeri lineari, portando a macromolecole globulari quasi monodisperse, con un gran numero di gruppi periferici. Di conseguenza, rappresentano un candidato ideale come vettore per il delivery, e per studiare gli effetti di dimensioni del polimero, carica, composizione e architettura, sulle proprietà biologicamente rilevanti quali le interazioni con il doppio strato lipidico, citotossicità, internalizzazione cellulare e interazioni con gli scomparti e organelli subcellulari. Gli studi di uptake cellulare condotti su cellule overesprimenti il recettore TSPO (cellule C6 di glioma di ratto), anche sotto l’influenza di specifici inibitori di endocitosi, mediante esperimenti di frazionamento cellulare e analisi di co-localizzazione (mediante microscopia CAT(Confocale-AFM-TIRF)), hanno evidenziato che questo nuovo nanosistema viene rapidamente internalizzato nelle cellule e soprattutto è in grado di direzionarsi selettivamente sul target mitocondriale. Inoltre, le limitazioni ascrivibili all’utilizzo di FITC come fluoroforo organico, sono state superate con la realizzazione di una nuova nanostruttura ibrida, descritta accuratamente nel capitolo 5, basata su QDs fluorescenti opportunamente funzionalizzati per il riconoscimento del recettore TSPO, con lo stesso ligando altamente affine e selettivo utilizzato per il dendrimero descritto nel capitolo precedente. In particolare, la progettazione razionale di nanoparticelle di QDs (QD@SiO2 NPs) rivestite di silice ammino-funzionalizzata, ha permesso lo sviluppo di una nanopiattafomra versatile per la funzionalizzazione con il ligando del TSPO. La stabilità colloidale e le proprietà ottiche di questo nuovo nanomateriale sono state accuratamente valutate. Gli esperimenti di frazionamento cellulare e l’analisi di microscopia confocale condotti sulle cellule C6 overesprimenti il recettore TSPO, hanno confermato il grande potenziale di questo nanosistema multifunzinale come agente selettivo per l’imaging mitocondriale in vitro.