MECHANISMS OF CHROMOSOMAL INSTABILITY: RELATIONSHIP BETWEEN TUMOR SUPPRESSORS AND SAC GENES

The majority of solid tumors are characterized by aneuploidy that is believed to be the consequence of chromosomal instability (CIN). The mechanisms leading to aneuploidy and the pathway (s) that allows its tolerance are not completely understood. The Spindle Assembly Checkpoint (SAC) is a cellular surveillance mechanism that works to maintain the genomic balance in mitosis. Alterations of SAC components can induce aneuploidy but it is not clear if these defects are sufficient for tumorigenesis. In this process the genetic background of the cell plays an important role. It is known that p53 defects allow cells to quickly proliferate tolerating CIN. On the contrary, activation of wt-p53 counteracts aneuploidy. Less is known about the role of the p14ARF tumor suppressor to counteract aneuploidy. In this thesis, I investigate the relationship between some of the SAC genes that if depleted induce aneuploidy and tumor suppressor genes. First, to investigate the role of p14ARF to counteract aneuploidy it was ectopically expressed in HCT116 cells (near diploid) after MAD2 depletion a crucial component of the SAC. MAD2 posttranscriptional silencing induced high levels of aneuploid cells and aberrant mitosis that decreased when p14ARF was simultaneously expressed. In addition, p14ARF ectopic expression in MAD2-depleted cells induced apoptosis associated with increased p53 protein levels. This response was not detected in HCT116 p53KO cells suggesting that p14ARF counteracts aneuploidy activating apoptosis p53-dependent. Second, I wanted to probe the relationship between the motor protein CENP-E, which works only in the SAC signaling, and aneuploidy in human cells. To this aim I used two types of cells, human primary fibroblasts (IMR90) and near diploid cells (HCT116) lacking p14ARF, and analyzed the effects of CENP-E depletion up to four weeks. These experiments showed a different response for the two cell types. Aneuploidy was tolerated for longer times in cells lacking p14ARF expression rather than in primary cells. In addition the observations that the reduction of aneuploidy in IMR90 cells was proportional to the increase of p14ARF gene expression, and that its ectopic expression in HCT116 cells reduced aneuploidy confirm the ability of p14ARF to counteract aneuploidy. Third, to improve these results I generated HCT116 cells expressing a functional p14ARF to assess the effects of CENP-E depletion. Collectively, these results suggest that the tumor suppressor p14ARF may have an important role to contrast aneuploidy activating a p53-dependent apoptosis pathway and that it is generally involved to counterbalance aneuploidy induced by different stimuli.

Caratteristica comune di molti tumori solidi è l’aneuploidia, conseguenza dell’instabilità cromosomica (CIN). Tuttavia non sono ancora chiari i meccanismi alla base dell’aneuploidia e i percorsi che permettono la sua tolleranza. Lo Spindle Assembly Checkpoint (SAC) è un meccanismo di sorveglianza cellulare che controlla la stabilità genomica durante la mitosi. Alterazioni nei membri del SAC generano aneuploidia, ma non è ancora chiaro se questi difetti sono sufficienti per promuovere la tumori-genesi. In questo processo, infatti, il contesto genetico della cellula gioca un ruolo importante. È risaputo che i difetti di p53 aiutano le cellule a proliferare velocemente tollerando la CIN. Al contrario, l’attivazione di una p53-wt contrasta l’aneuploidia. Poco si sa, invece, circa il ruolo del tumor suppressor p14ARF nel contrastare l’aneuploidia. In questa tesi ho voluto valutare la relazione tra alcuni geni del SAC, la cui deplezione induce aneuploidia, e i geni tumor suppressor. Inizialmente, per indagare sul ruolo di p14ARF nel contrastare l’aneuploidia, l’ho espresso ectopicamente in cellule HCT116 (quasi diploidi) dopo aver ridotto, in contemporanea, l’espressione del gene MAD2, elemento cruciale del SAC. Il silenziamento post-trascrizionale di MAD2 ha indotto alti livelli di aneuploidia e di mitosi anomale, che sono diminuiti con l’espressione contemporanea di p14ARF. Inoltre, l’espressione ectopica di p14ARF in cellule MAD2-deplete ha attivato un percorso apoptotico, associato a un incremento della proteina p53. Questa risposta non è stata rilevata in cellule HCT116 p53KO, suggerendo che p14ARF contrasta l’aneuploidia attivando un’apoptosi p53-dipendente. Poi, ho voluto approfondire la relazione tra la proteina motrice Cenp-E, che funziona solo nell’attivazione del SAC, e l’aneuploidia in cellule umane. A tal fine, ho utilizzato due diversi tipi cellulari, fibroblasti primari umani IMR90 e cellule HCT116 che non esprimono la proteina p14ARF, analizzando gli effetti della deplezione di Cenp-E fino a quattro settimane. I due tipi cellulari hanno risposto in maniera differente poiché l’aneuploidia è più tollerata dalle cellule che non esprimono p14ARF piuttosto che dai fibroblasti primari. Inoltre, l’osservazione che la riduzione dell’aneuploidia nelle IMR90 coincide con l’incremento di p14ARF e che la sua espressione ectopica riduce l’aneuploidia nelle HCT116 conferma l’abilità del gene di contrastare l’aneuploidia. Infine, per approfondire questi risultati, ho generato cellule HCT116 che esprimono una proteina p14ARF funzionale, in cui ho valutato gli effetti della deplezione di Cenp-E. In conclusione, questi risultati suggeriscono che p14ARF potrebbe avere un ruolo importante nel contrastare l’aneuploidia attivando un’apoptosi p53-dipendente e che, in maniera più generale, è coinvolto nell’ostacolare l’aneuploidia indotta da differenti stimoli.