Role of THAP11 in the transcriptional regulation and chromatin structure of the human MYC locus

C-MYC is one of the most frequently deregulated genes in human tumors. A detailed understanding of c-MYC transcriptional control is essential to better understand the molecular aspects of its several functions. We have characterized an enhancer blocker element (HB2.8) located 32Kb downstream of the c-MYC gene, by using different methods (EMSA assay, 2D-IPG and MALDI analysis). Stable and transient transfection assays have shown that the activity of the enhancer-blocking, can be imputated to a DNA sub-region of about 400 bp called AA0.4 Additional tests to evaluate the enhancer-blocking activity of this sequence demonstrate that this sub-region, interposed between c-Myc and Pvt-1 genes, is able to block communication between the enhancer PA-A (gene c-Myc) and the Pvt-1 promoter. It is well known that the enhancer-blocker are nucleoprotein structures, requiring for correct operation the binding with protein complexes. Through Mass Spectrometry assay, we identified several proteins able to bind this region. Among them, we focalized our attention on THAP11 (Thanatos-associated proteins 11), a member of THAP proteins family, which is involved in cell proliferation, apoptosis, chromatin modification and transcriptional regulation. The THAP11 gene, maps to a locus on chromosome 16q22.1 and encode for a 314-amino acid protein with a conserved THAP zinc finger domain (1–90aa), a putative nuclear localization signal (NLS) (98–104) at theN-terminus, and a 29- residue repeat polyglutamine motif(104–132 residues) at the C terminus. In the last few years many studies about THAP11 have been conducted, demonstrating that this protein normally localizes into the nuclei of cells, it is ubiquitously expressed in normal tissues and frequently down regulated in several human tumor tissues (Zhu et al., 2009);. To further evaluate the role of THAP11 on c-MYC gene transcription, we investigated the binding of THAP11 to the c-MYC gene P2 promoter and HB2.8 enhancer blocker element. To this end, we performed Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in HELA and U937 cells. Our experiments demonstrate that THAP11 binds to the HB2.8 enhancer blocker and the P2 c-MYC promoter and that this occupancy correlate to the level of c-MYC expression during U937 cells differentiation . We hypothesized that c-MYC expression may be regulated by the interaction of the P2 promoter and the HB2.8 enhancer blocker element, mediated by THAP11. To confirm this hypothesis, we investigated the genomic organization around the c-MYC locus by using chromosome conformation capture (3C) and a qPCR based analysis. The 3C experiments confirmed an enrichment in the interaction frequency between the c-Myc P2 promoter and HB2.8 in U937 differentiated cells compared to U937 proliferanting cells, suggesting that THAP11 may be involved in c-MYC locus chromatin remodeling. Further studies, using 2D-FISH, are in progress to identified chromosome territories associated to HB2.8 and P2 c-MYC promoter in proliferating and differentiate U937 cells.

C-MYC è uno dei geni più frequentemente deregolati nei tumori umani. Una comprensione dettagliata della regolazione trascrizionale di questo gene è essenziale per comprendere meglio gli aspetti molecolari delle sue diverse funzioni. Usando diversi tipi di analisi (EMSA, 2D-IPG e analisi MALDI), nei nostri laboratori abbiamo caratterizzato un elemento con funzione di enhancer blocker (HB2.8) situato 32Kb valle del gene c-MYC . Saggi di trasfezione transiente e stabile hanno dimostrato che l'attività dell’elemento enhancer-blocker può essere attribuita esclusivamente ad un sub-regione di DNA di circa 400 bp chiamato AA0.4. Ulteriori test per valutare l'attività enhancer blocker di questa sequenza dimostrano che questa sotto-regione, interposta tra c-Myc e Pvt-1 geni, è in grado di bloccare la comunicazione tra l'enhancer trascrizionale PA-A del gene c-Myc e il promotore del gene Pvt -1 situato a valle. E' ben noto che gli enhancer blocker sono strutture nucleoproteiche, che richiedono quindi per il corretto funzionamento il legame con complessi proteici. Sono state identificate tramite test di Spettrometria di Massa diverse proteine in grado di legarsi a questa regione. Tra queste, la nostra attenzione si è focalizzata su THAP11 (Thanatos-Associated Protein 11), un membro della famiglia delle proteine THAP, coinvolto nella proliferazione cellulare, nell’apoptosi, nella modifica della struttura della cromatina e nella regolazione trascrizionale. Il gene di THAP11 si trova sul cromosoma 16q22.1 e codifica per una proteina di 314-amino che presenta un dominio conservato di tipo Zinc-finger, un segnale di localizzazione nucleare (NLS) (98-104), e un motivo ripetuto composto da 29 glutammine (104-132 residui) al C terminale. Negli ultimi anni sono stati condotti molti studi su THAP11, dimostrando che questa proteina si trova normalmente nei nuclei delle cellule, che è ubiquitariamente espressa in tessuti normali e frequentemente down regolata in diversi tessuti tumorali umani (Zhu et al., 2009); . Al fine di valutare il ruolo di THAP11 sulla regolazione trascrizionale del gene c-MYC, abbiamo studiato la possibile interazione tra THAP11, il promotore P2 di c-MYC e l’elemento enhancer blocker HB2.8. Saggi di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) in HELA e U937 hanno dimostrato che THAP11 lega la sequenza enhancer blocker HB2.8, il promotore P2 e che tale capacità di legame è correlata al livello di espressione c-MYC, a sua volta dipendente dal differenziamento delle cellule U937. Abbiamo ipotizzato che l'espressione di c-MYC possa dipendere dall'interazione del promotore P2 e l'elemento enhancer blocker HB2.8, mediata da THAP11. Per confermare questa ipotesi, abbiamo studiato l'organizzazione cromatinica del locus c-MYC utilizzando la tecnica Chromosome Conformation Capture (3C) ed una analisi basata su Real Time PCR. Gli esperimenti di 3C hanno confermato un arricchimento nella frequenza di interazione tra il promotore c-Myc P2 e la sequenza HB2.8 in cellule differenziate U937 rispetto alle cellule proliferanti, suggerendo che THAP11 può essere coinvolto nel rimodellamento della cromatina del locus MYC. Sono in corso Ulteriori studi, utilizzando la tecnica 2D-FISH, per identificare “Chromosome Territories” associati ad HB2.8 e al promotore P2 in cellule U937 proliferanti e differenziate.