APPLICATION OF MOLECULAR MARKERS FOR GENETIC TRACEABILITY OF SICILIAN AUTOCHTHONOUS BREEDS AND TYPICAL DAIRY PRODUCTS

The Sicilian cattle, sheep and goat breeds and their dairy products are an important source for the economy of livestock sector. Some of these dairy products are “mono-breed” and are important elements for the conservation and valorization of animal populations, territories and traditions. Valorization, authentication, and traceability of dairy products require wide knowledge on breeds genetic structure, morphological and attitudinal traits, geographic distribution/environment, and genetic diversity within and among breeds. Molecular traceability is a useful tool for preservation and valorization of typical products that can lead to develop marginal areas, to promote the conservation of biodiversity and, therefore, the protection of local breeds. The application of molecular markers, such as microsatellites and mitochondrial DNA, is a very important tool to study the genetic diversity of caprine, bovine and ovine Sicilian autochthonous breeds and for characterization and valorization of their dairy products. In this thesis, microsatellite markers were used for analysis of Girgentana goat breed individuals and dairy products. Moreover, mitochondrial DNA was considered for its species specificity in order to develop molecular protocols for authentication and traceability of mono-species Sicilian dairy products. The overall aim of this thesis was the application of molecular technologies for the characterization and valorization of Sicilian autochthonous breeds for genetic traceability of typical dairy products. In Chapter 2, a total of 388 individual samples of Girgentana, Maltese and Derivata di Siria Sicilian autochthonous goat breeds were analyzed by 20 microsatellite markers in order to identify breed specific microsatellite markers that can be used for traceability of Girgentana dairy products. Private alleles were found in each analyzed breed but we focused our attention mainly on alleles present at the same time in Maltese and Derivata di Siria and absent in Girgentana. Only eight microsatellite markers within the analyzed panel showed these alleles and, therefore, they were tested on DNA pools of each breed. Three markers, FCB20, SRCRSP5, and TGLA122 presented alleles useful for traceability purpose of Girgentana dairy products, and they were tested on DNA samples extracted from cheeses. Considering our results, these microsatellite markers could be applied in a genetic traceability system of Girgentana dairy products in order to detect adulteration due to Maltese and Derivata di Siria goat milk. In Chapter 3, species-specific multiplex-PCR protocols for identification of cattle’s, sheep’s and goat’s milk in mono-species Sicilian dairy products were reported. DNA from blood and experimental cheeses of Sicilian autochthonous breeds was extracted to amplify the 12S and 16S rRNA genes of mitochondrial DNA. Fragments of different length were obtained using specific primers for ovine, bovine and caprine species (172 bp, 256 bp, and 326 bp, respectively). In next step, multiplex-PCR protocols were applied on mixtures of DNA pools and results showed a sensitive threshold of 0.1% for bovine/caprine and ovine/caprine DNA mixtures, and 0.5% for bovine/ovine and ovine/bovine DNA mixtures. Finally, the same assay was applied to bovine/ovine experimental cheeses to detect the minimum threshold of milk adulteration. The results showed a sensitive threshold of 0.1% for bovine/ovine cheeses and 0.5% for ovine/bovine ones. The proposed assay represents a rapid and straightforward method for the detections of adulteration in mono-species dairy products.

In Sicilia, le razze bovine, ovine e caprine e le loro produzioni lattiero-casearie rappresentano una risorsa importante per l’economia del settore zootecnico. Alcuni di questi prodotti di origine animale sono “prodotti monorazza” e rappresentano elementi importanti per la conservazione e lo sviluppo di queste popolazioni, dei territori e delle tradizioni locali. Il processo di valorizzazione, autenticazione e tracciabilità delle produzioni lattiero-casearie richiede una conoscenza approfondita sulla struttura genetica delle razze, sulle caratteristiche morfologiche e attitudinali, sulla distribuzione geografica/ambiente di produzione e sulla diversità genetica entro e tra razze. Uno strumento utile per la tutela e la valorizzazione dei prodotti tipici, che possono portare allo sviluppo di aree marginali, favorendo la conservazione della biodiversità e di conseguenza la tutela delle razze locali, è rappresentato dalla tracciabilità molecolare. L’applicazione di marcatori molecolari, quali i microsatelliti e il DNA mitocondriale, è uno strumento importante per studiare la diversità genetica delle razze caprine, bovine e ovine autoctone siciliane e per la caratterizzazione e la valorizzazione delle loro produzioni lattiero-casearie. In questa tesi, sono stati utilizzati i marcatori microsatelliti per analizzare non solo gli individui di razza caprina Girgentana ma anche le produzioni lattiero-casearie da essa derivate. Inoltre, è stato preso in considerazione il DNA mitocondriale, grazie alla sua specificità, per sviluppare protocolli molecolari utili per autenticare e tracciare le produzioni lattiero-casearie siciliane mono-specie. L’obiettivo generale di questa tesi è l’applicazione di tecnologie molecolari per la caratterizzazione e valorizzazione delle razze autoctone siciliane e per la tracciabilità genetica delle produzioni lattiero-casearie tipiche siciliane da esse derivate. Nel capitolo 2, sono stati analizzati 20 marcatori microsatelliti in 388 campioni individuali appartenenti alle razze caprine autoctone Siciliane: Girgentana, Maltese e Derivata di Siria al fine di tracciare i prodotti lattiero-caseari di razza Girgentana. In ogni razza analizzata sono stati rilevati alleli privati, ma la nostra attenzione si è focalizzata principalmente sugli alleli presenti contemporaneamente nelle razze caprine Maltese e Derivata di Siria e assenti nella razza Girgentana. All’interno del pannello analizzato, solo 8 marcatori microsatelliti hanno mostrato questi alleli e, pertanto, sono stati testati su pool di DNA delle tre razze. In particolare, 3 marcatori (FCB20, SRCRSP5 e TGLA122) presentavano alleli utili per il sistema di tracciabilità dei prodotti lattiero-casearie pertanto sono stati testati su campioni di DNA estratti da formaggio. Considerando i risultati ottenuti, questi marcatori microsatelliti potrebbero essere applicati in un sistema di tracciabilità genetica dei prodotti lattiero-caseari di razza Girgentana al fine di rilevare eventuali adulterazioni causate dall’aggiunta di latte caprino di razza Maltese e Derivata di Siria. Nel capitolo 3, sono stati riportati i protocolli di multiplex-PCR per identificare la presenza di latte di individui appartenenti alle specie bovina, ovina e caprina in prodotti lattiero-caseari Siciliani mono-specie. Dal sangue di individui appartenenti alle principali razze autoctone Siciliane e dai formaggi sperimentali è stato estratto il DNA per l’amplificazione dei geni 12S e 16S rRNA del DNA mitocondriale. L’uso di primers specie-specifici ha permesso l’amplificazione di frammenti di diversa lunghezza per le specie ovina, bovina e caprina, rispettivamente di 172 bp, 256 bp e 326 bp. Nella fase successiva, il protocollo di multiplex-PCR è stato applicato a pools di DNA ed i risultati hanno evidenziato una soglia di detezione dello 0,1% per le miscele di pools di DNA bovino/caprino e ovino/caprino, mentre una soglia di detezione dello 0,5% per le miscele di pools di DNA bovino/ovino e ovino/bovino. Infine lo stesso protocollo è stato applicato ai campioni di DNA estratto dai formaggi sperimentali al fine di rilevare la soglia minima di adulterazione nel latte. I risultati fin qui ottenuti hanno mostrato una soglia di detezione dello 0,1% di latte ovino in formaggi bovini e dello 0,5% di latte bovino in formaggi ovini. Il test proposto rappresenta un metodo rapido e semplice per rilevare eventuali adulterazioni dei prodotti lattiero-caseari mono-specie.