The genetic diversity of farm animal species and breeds is an important resource in all livestock systems. To evaluate genetic diversity in livestock populations several methods have been developed based on pedigree information or on molecular data. The increasing availability of molecular markers for most farm animal species and the development of techniques to analyze molecular variation are widening the capacity to characterize breeds genetic variation. Moreover, little is known about the genetic diversity in Sicilian livestock breeds and populations. The aim of this thesis was to explore the genetic diversity of the Sicilian autochthonous breeds and populations using molecular markers. In chapter 2, the promoter region of ovine -lactoglobulin (BLG) gene was sequenced in order to identify polymorphisms, infer and analyze haplotypes, and phylogenetic relationship among the Valle del Belice sheep breed and other three breeds considered as ancestors. Sequencing analysis and alignment of the obtained sequences showed the presence of 36 single nucleotide polymorphisms (SNPs) and one deletion. We found four binding sites for milk protein binding factors (MPBFs) and five binding sites for nuclear factor-I (NF-I). The number of identified polymorphisms showed high variability within breeds. A total of 22 haplotypes found in best reconstruction were inferred considering all 37 polymorphic sites. Haplotypes were used for the reconstruction of a phylogenetic tree using the Neighbor-Joining algorithm. Analysis of genetic diversity indexes showed that the Sarda sheep breed presented the lowest nucleotide diversity, whereas the Comisana sheep breed presented the highest one. Comparing the nucleotide diversity among breeds, the highest value was obtained between Valle del Belice and Pinzirita sheep breeds, whereas the lowest one was between Valle del Belice and Sarda sheep breeds. Considering that polymorphisms in the promoter region of BLG gene could have a functional role associated with milk composition, the lowest value of nucleotide diversity between Valle del Belice and Sarda sheep breeds may be related to a higher similarity of milk composition of these two breeds compared to the others. In Chapter 3, microsatellite markers were used to explore the genetic structure of the four Sicilian autochthonous and Sarda sheep breeds, and to determine their genetic relationship. A total of 259 alleles were observed with average polymorphic information content (PIC) equal to 0.76, showing that the used microsatellites panel was highly informative. The low value of genetic differentiation among breeds (Fst=0.049) may indicate that these breeds have a low differentiation level probably due to common history and breeding practices. The low Fis and Fit values indicated low level of inbreeding within and among breeds. The Unrooted Neighbor-Joining dendrogram obtained from the Reynold’s genetic distances, and factorial correspondence analysis revealed a separation between Barbaresca and the other sheep breeds. The Bayesian assignment test showed that Barbaresca and Sarda sheep breeds had more defined genetic structure, whereas the lowest assignment value was found in the Pinzirita sheep breed. Our results indicated high genetic variability, low inbreeding and low genetic differentiation, except for Barbaresca sheep breed, and were in accordance with geographical location, history, and breeding practices. The low robustness of the assignment test makes it unfeasible for traceability purposes, due to the high level of admixture, in particular for Sicilian dairy sheep breeds. In Chapter 4 were reported for the first time the estimates of population structure, the levels of inbreeding (F) and coancestry (f), and the linkage disequilibrium (LD) in two Sicilian autochthonous cattle breeds, the Cinisara and the Modicana, using the Illumina Bovine SNP50K v2 BeadChip. Principal Components Analysis and Bayesian clustering algorithm showed that animals from the two Sicilian breeds formed non-overlapping clusters and are clearly separated populations, even from the Holstein control population. The average molecular F and f coefficients were moderately high, and the current estimates of Ne were low in both breeds. These values indicated a low genetic variability. The average r2 was notably lower than the values observed in other cattle breeds. The highest r2 values were found in chromosome 14, where causative mutations affecting variation in milk production traits have been reported. The low value of LD indicated that the present chip is not an optimum, and that a denser SNP array is needed to capture more LD information. The levels of inbreeding and Ne reported in this study point out the need to establish a conservation program for these autochthonous cattle breeds. In Chapter 5 genome wide levels of LD, the number of haplotype blocks for each chromosome in each breed and the genetic diversity was assessed in the Sicilian dairy sheep breeds, using the Illumina Ovine SNP50K v1 BeadChip. The LD declined as a function of distance and average r2 was notably lower than the value observed in other sheep breeds. Few and small haplotype blocks were observed in Comisana and Pinzirita sheep breeds, which contained just two SNPs. The number of haplotype blocks reported in our study for the Sicilian dairy sheep breeds were extremely lower than those reported in other livestock species. PCA showed that while Valle del Belice and Pinzirita sheep breeds formed a unique cluster, the Comisana sheep breed showed the presence of substructure. PCA using a subset of SNPs showed lack of ability to discriminate among the breeds. The Pinzirita sheep breed displayed the highest genetic diversity, whereas the lowest value was found in the Valle del Belice sheep breed. The information generated from this study has important implications for the design and applications of association studies as well as for the development of selection breeding programs.

La diversità genetica delle specie e razze di interesse zootecnico, rappresenta un’importante risorsa in tutti i sistemi di allevamento . Per lo studio della diversità genetica, nel corso dei decenni sono stati sviluppati diversi metodi che si basano su informazioni del pedigree o su dati molecolari (microsatelliti e SNPs, Single Nucleotide Polymorphisms). Con l’aumento della disponibilità di marcatori molecolari per la maggior parte delle specie di interesse zootecnico, e con lo sviluppo di sofisticate tecniche analitiche, sta crescendo la capacità di caratterizzare la variabilità genetica delle razze. Inoltre, ad oggi, poche sono le informazioni sulla diversità genetica delle razze e delle popolazioni autoctone siciliane. L’obiettivo di questa tesi è stato quello di studiare la diversità e la struttura genetica nelle razze e popolazioni zootecniche autoctone siciliane mediante l’uso di marcatori molecolari. Nel capitolo 2 è stata sequenziata la regione promoter del gene della -lattoglobulina (BLG) ovina al fine di individuare i polimorfismi, calcolare e analizzare gli aplotipi e studiare le relazione filogenetiche tra la razza Valle del Belice e le altre razze considerate sue progenitrici. L’allineamento e l’analisi delle sequenze ottenute hanno evidenziato la presenza di 36 SNPs e una delezione, sottolineando un’elevata variabilità all’interno delle razze. Sono stati individuati quattro siti di legame per Milk Protein Binding Factors (MPBFs) e cinque siti di legame Nuclear Factor-I (NF-I). Utilizzando i siti polimorfici identificati, sono stati calcolati 22 aplotipi, usati per la ricostruzione di un albero filogenetico tramite l’algoritmo Neighbor-Joining. L’analisi degli indici di diversità genetica ha mostrato valori più bassi di diversità nucleotidica per la razza Sarda, mentre la razza Comisana ha presentato i valori più alti. Confrontando la diversità nucleotidica tra le razze, il valore più alto è stato ottenuto tra le razze Valle del Belice e Pinzirita, mentre quello più basso è stato ottenuto tra la razza Valle del Belice e la razza Sarda. Considerando che i polimorfismi nella regione promoter del gene della BLG potrebbero avere un ruolo funzionale associato alla composizione del latte, il valore più basso della diversità nucleotidica tra le razze Valle del Belice e Sarda, potrebbe essere correlato ad una maggiore somiglianza nella produzione qualitativa del latte di queste due razze rispetto alle altre. Nel capitolo 3, un pannello di 20 marcatori microsatelliti è stato utilizzato per studiare e caratterizzare la struttura genetica delle quattro razze ovine autoctone siciliane (Barbaresca, Comisana, Pinzirita e Valle del Belice) e della razza Sarda, e per determinare le relazioni filogenetiche che intercorrono tra esse. Il numero di alleli trovati (259) ed il contenuto di informazione polimorfica (PIC) indicano che il pannello utilizzato è altamente informativo (0,76). I valori di Fst, Fis e Fit hanno mostrato una bassa differenziazione genetica e bassi livelli di consanguineità all’interno delle razze e tra esse. Il dendrogramma Neighbor-Joining, ottenuto sulla base delle distanze genetiche di Reynold, e l’analisi delle corrispondenti fattoriali, hanno evidenziato una marcata separazione tra la razza Barbaresca e le altre razze ovine. Il test di assegnazione bayesiano ha mostrato una struttura genetica più omogenea per le razze Barbaresca e Sarda, mentre il più basso valore di assegnazione è stato trovato nella razza Pinzirita. I nostri risultati indicano la presenza di una elevata variabilità, bassa consanguineità e bassa differenziazione genetica, fatta eccezione per la razza Barbaresca, in accordo con la posizione geografica, i possibili flussi genici e le pratiche di allevamento. La bassa robustezza del test di assegnazione rende inutilizzabile l’uso dei marcatori microsatelliti ai fini della tracciabilità delle produzioni lattiero casearie, a causa dell’elevata promiscuità e del flusso genico, in particolare per le razze ovine da latte autoctone siciliane. Nel capitolo 4 vengono riportate per la prima volta, le stime riguardanti la struttura genetica, i livelli di inbreeding (F) e coancestry (f) e il linkage disequilibrium(LD) nelle razze bovine autoctone siciliane Cinisara e Modicana, utilizzando l’Illumina Bovine SNP50K v2 BeadChip. L’Analisi delle Componenti Principali (PCA) e l’algoritmo di assegnazione basato sulla statistica bayesiana, hanno mostrato che gli animali delle due razze formano due clusters distinti. I coefficienti F e f erano moderatamente elevati, mentre le attuali stime sulla effettiva dimensione della popolazione (Ne) erano basse in entrambe le razze, sottolineando una bassa variabilità genetica. Il valore medio del LD calcolato con r2 è risultato notevolmente inferiore rispetto ai valori medi riportati in letteratura per le altre razze bovine. I più alti valori di r2 sono stati trovati nel cromosoma 14, all’interno del quale sono state descritte diverse mutazioni che influenzano la produzione quanti-qualitativa del latte. Il basso valore di LD suggerisce che il presente chip non è ottimale, e che un pannello a più alta densità è necessario per acquisire le informazioni riguardanti i livelli di LD, mentre i parametri riguardanti la consanguineità e Ne, indicano la necessità di avviare programmi di conservazione per il recupero di queste razze bovine autoctone. Il capitolo 5 riporta i risultati relativi al calcolo del LD, alla stima del numero di blocchi di aplotipi per cromosoma e alla diversità genetica nelle razze ovine autoctone siciliane allevate per la produzione di latte, utilizzando gli Ovine Beadchip SNP50K v1 BeadChip. I valori del LD diminuivano in funzione della distanza e la media del coefficiente r2 era notevolmente inferiore al valore osservato nelle altre razze ovine. Sono stati trovati un ridotto numero di blocchi di aplotipi e un ridotto numero di SNPs per blocco, in particolare nelle razze Comisana e Pinzirita. La PCA ha mostrato che, mentre la Valle del Belice e la Pinzirita formano due gruppi omogenei e distinti per razza, la Comisana evidenzia la presenza di sottostrutture. La PCA condotta con un subset di SNPs ha mostrato una scarsa capacità di discriminare le razze tra loro. La razza Pinzirita ha evidenziato i più alti livelli di diversità genetica, mentre i valori più bassi sono stati riscontrati nella razza Valle del Belice. Le informazioni generate da questo studio potrebbero essere utilizzate per gli studi di associazione, nonché per lo sviluppo di programmi di selezione e miglioramento genetico.

Mastrangelo, . (2014). Application of molecular markers to investigate genetic diversity in Sicilian livestock.

Application of molecular markers to investigate genetic diversity in Sicilian livestock

MASTRANGELO, Salvatore
2014-02-25

Abstract

The genetic diversity of farm animal species and breeds is an important resource in all livestock systems. To evaluate genetic diversity in livestock populations several methods have been developed based on pedigree information or on molecular data. The increasing availability of molecular markers for most farm animal species and the development of techniques to analyze molecular variation are widening the capacity to characterize breeds genetic variation. Moreover, little is known about the genetic diversity in Sicilian livestock breeds and populations. The aim of this thesis was to explore the genetic diversity of the Sicilian autochthonous breeds and populations using molecular markers. In chapter 2, the promoter region of ovine -lactoglobulin (BLG) gene was sequenced in order to identify polymorphisms, infer and analyze haplotypes, and phylogenetic relationship among the Valle del Belice sheep breed and other three breeds considered as ancestors. Sequencing analysis and alignment of the obtained sequences showed the presence of 36 single nucleotide polymorphisms (SNPs) and one deletion. We found four binding sites for milk protein binding factors (MPBFs) and five binding sites for nuclear factor-I (NF-I). The number of identified polymorphisms showed high variability within breeds. A total of 22 haplotypes found in best reconstruction were inferred considering all 37 polymorphic sites. Haplotypes were used for the reconstruction of a phylogenetic tree using the Neighbor-Joining algorithm. Analysis of genetic diversity indexes showed that the Sarda sheep breed presented the lowest nucleotide diversity, whereas the Comisana sheep breed presented the highest one. Comparing the nucleotide diversity among breeds, the highest value was obtained between Valle del Belice and Pinzirita sheep breeds, whereas the lowest one was between Valle del Belice and Sarda sheep breeds. Considering that polymorphisms in the promoter region of BLG gene could have a functional role associated with milk composition, the lowest value of nucleotide diversity between Valle del Belice and Sarda sheep breeds may be related to a higher similarity of milk composition of these two breeds compared to the others. In Chapter 3, microsatellite markers were used to explore the genetic structure of the four Sicilian autochthonous and Sarda sheep breeds, and to determine their genetic relationship. A total of 259 alleles were observed with average polymorphic information content (PIC) equal to 0.76, showing that the used microsatellites panel was highly informative. The low value of genetic differentiation among breeds (Fst=0.049) may indicate that these breeds have a low differentiation level probably due to common history and breeding practices. The low Fis and Fit values indicated low level of inbreeding within and among breeds. The Unrooted Neighbor-Joining dendrogram obtained from the Reynold’s genetic distances, and factorial correspondence analysis revealed a separation between Barbaresca and the other sheep breeds. The Bayesian assignment test showed that Barbaresca and Sarda sheep breeds had more defined genetic structure, whereas the lowest assignment value was found in the Pinzirita sheep breed. Our results indicated high genetic variability, low inbreeding and low genetic differentiation, except for Barbaresca sheep breed, and were in accordance with geographical location, history, and breeding practices. The low robustness of the assignment test makes it unfeasible for traceability purposes, due to the high level of admixture, in particular for Sicilian dairy sheep breeds. In Chapter 4 were reported for the first time the estimates of population structure, the levels of inbreeding (F) and coancestry (f), and the linkage disequilibrium (LD) in two Sicilian autochthonous cattle breeds, the Cinisara and the Modicana, using the Illumina Bovine SNP50K v2 BeadChip. Principal Components Analysis and Bayesian clustering algorithm showed that animals from the two Sicilian breeds formed non-overlapping clusters and are clearly separated populations, even from the Holstein control population. The average molecular F and f coefficients were moderately high, and the current estimates of Ne were low in both breeds. These values indicated a low genetic variability. The average r2 was notably lower than the values observed in other cattle breeds. The highest r2 values were found in chromosome 14, where causative mutations affecting variation in milk production traits have been reported. The low value of LD indicated that the present chip is not an optimum, and that a denser SNP array is needed to capture more LD information. The levels of inbreeding and Ne reported in this study point out the need to establish a conservation program for these autochthonous cattle breeds. In Chapter 5 genome wide levels of LD, the number of haplotype blocks for each chromosome in each breed and the genetic diversity was assessed in the Sicilian dairy sheep breeds, using the Illumina Ovine SNP50K v1 BeadChip. The LD declined as a function of distance and average r2 was notably lower than the value observed in other sheep breeds. Few and small haplotype blocks were observed in Comisana and Pinzirita sheep breeds, which contained just two SNPs. The number of haplotype blocks reported in our study for the Sicilian dairy sheep breeds were extremely lower than those reported in other livestock species. PCA showed that while Valle del Belice and Pinzirita sheep breeds formed a unique cluster, the Comisana sheep breed showed the presence of substructure. PCA using a subset of SNPs showed lack of ability to discriminate among the breeds. The Pinzirita sheep breed displayed the highest genetic diversity, whereas the lowest value was found in the Valle del Belice sheep breed. The information generated from this study has important implications for the design and applications of association studies as well as for the development of selection breeding programs.
25-feb-2014
La diversità genetica delle specie e razze di interesse zootecnico, rappresenta un’importante risorsa in tutti i sistemi di allevamento . Per lo studio della diversità genetica, nel corso dei decenni sono stati sviluppati diversi metodi che si basano su informazioni del pedigree o su dati molecolari (microsatelliti e SNPs, Single Nucleotide Polymorphisms). Con l’aumento della disponibilità di marcatori molecolari per la maggior parte delle specie di interesse zootecnico, e con lo sviluppo di sofisticate tecniche analitiche, sta crescendo la capacità di caratterizzare la variabilità genetica delle razze. Inoltre, ad oggi, poche sono le informazioni sulla diversità genetica delle razze e delle popolazioni autoctone siciliane. L’obiettivo di questa tesi è stato quello di studiare la diversità e la struttura genetica nelle razze e popolazioni zootecniche autoctone siciliane mediante l’uso di marcatori molecolari. Nel capitolo 2 è stata sequenziata la regione promoter del gene della -lattoglobulina (BLG) ovina al fine di individuare i polimorfismi, calcolare e analizzare gli aplotipi e studiare le relazione filogenetiche tra la razza Valle del Belice e le altre razze considerate sue progenitrici. L’allineamento e l’analisi delle sequenze ottenute hanno evidenziato la presenza di 36 SNPs e una delezione, sottolineando un’elevata variabilità all’interno delle razze. Sono stati individuati quattro siti di legame per Milk Protein Binding Factors (MPBFs) e cinque siti di legame Nuclear Factor-I (NF-I). Utilizzando i siti polimorfici identificati, sono stati calcolati 22 aplotipi, usati per la ricostruzione di un albero filogenetico tramite l’algoritmo Neighbor-Joining. L’analisi degli indici di diversità genetica ha mostrato valori più bassi di diversità nucleotidica per la razza Sarda, mentre la razza Comisana ha presentato i valori più alti. Confrontando la diversità nucleotidica tra le razze, il valore più alto è stato ottenuto tra le razze Valle del Belice e Pinzirita, mentre quello più basso è stato ottenuto tra la razza Valle del Belice e la razza Sarda. Considerando che i polimorfismi nella regione promoter del gene della BLG potrebbero avere un ruolo funzionale associato alla composizione del latte, il valore più basso della diversità nucleotidica tra le razze Valle del Belice e Sarda, potrebbe essere correlato ad una maggiore somiglianza nella produzione qualitativa del latte di queste due razze rispetto alle altre. Nel capitolo 3, un pannello di 20 marcatori microsatelliti è stato utilizzato per studiare e caratterizzare la struttura genetica delle quattro razze ovine autoctone siciliane (Barbaresca, Comisana, Pinzirita e Valle del Belice) e della razza Sarda, e per determinare le relazioni filogenetiche che intercorrono tra esse. Il numero di alleli trovati (259) ed il contenuto di informazione polimorfica (PIC) indicano che il pannello utilizzato è altamente informativo (0,76). I valori di Fst, Fis e Fit hanno mostrato una bassa differenziazione genetica e bassi livelli di consanguineità all’interno delle razze e tra esse. Il dendrogramma Neighbor-Joining, ottenuto sulla base delle distanze genetiche di Reynold, e l’analisi delle corrispondenti fattoriali, hanno evidenziato una marcata separazione tra la razza Barbaresca e le altre razze ovine. Il test di assegnazione bayesiano ha mostrato una struttura genetica più omogenea per le razze Barbaresca e Sarda, mentre il più basso valore di assegnazione è stato trovato nella razza Pinzirita. I nostri risultati indicano la presenza di una elevata variabilità, bassa consanguineità e bassa differenziazione genetica, fatta eccezione per la razza Barbaresca, in accordo con la posizione geografica, i possibili flussi genici e le pratiche di allevamento. La bassa robustezza del test di assegnazione rende inutilizzabile l’uso dei marcatori microsatelliti ai fini della tracciabilità delle produzioni lattiero casearie, a causa dell’elevata promiscuità e del flusso genico, in particolare per le razze ovine da latte autoctone siciliane. Nel capitolo 4 vengono riportate per la prima volta, le stime riguardanti la struttura genetica, i livelli di inbreeding (F) e coancestry (f) e il linkage disequilibrium(LD) nelle razze bovine autoctone siciliane Cinisara e Modicana, utilizzando l’Illumina Bovine SNP50K v2 BeadChip. L’Analisi delle Componenti Principali (PCA) e l’algoritmo di assegnazione basato sulla statistica bayesiana, hanno mostrato che gli animali delle due razze formano due clusters distinti. I coefficienti F e f erano moderatamente elevati, mentre le attuali stime sulla effettiva dimensione della popolazione (Ne) erano basse in entrambe le razze, sottolineando una bassa variabilità genetica. Il valore medio del LD calcolato con r2 è risultato notevolmente inferiore rispetto ai valori medi riportati in letteratura per le altre razze bovine. I più alti valori di r2 sono stati trovati nel cromosoma 14, all’interno del quale sono state descritte diverse mutazioni che influenzano la produzione quanti-qualitativa del latte. Il basso valore di LD suggerisce che il presente chip non è ottimale, e che un pannello a più alta densità è necessario per acquisire le informazioni riguardanti i livelli di LD, mentre i parametri riguardanti la consanguineità e Ne, indicano la necessità di avviare programmi di conservazione per il recupero di queste razze bovine autoctone. Il capitolo 5 riporta i risultati relativi al calcolo del LD, alla stima del numero di blocchi di aplotipi per cromosoma e alla diversità genetica nelle razze ovine autoctone siciliane allevate per la produzione di latte, utilizzando gli Ovine Beadchip SNP50K v1 BeadChip. I valori del LD diminuivano in funzione della distanza e la media del coefficiente r2 era notevolmente inferiore al valore osservato nelle altre razze ovine. Sono stati trovati un ridotto numero di blocchi di aplotipi e un ridotto numero di SNPs per blocco, in particolare nelle razze Comisana e Pinzirita. La PCA ha mostrato che, mentre la Valle del Belice e la Pinzirita formano due gruppi omogenei e distinti per razza, la Comisana evidenzia la presenza di sottostrutture. La PCA condotta con un subset di SNPs ha mostrato una scarsa capacità di discriminare le razze tra loro. La razza Pinzirita ha evidenziato i più alti livelli di diversità genetica, mentre i valori più bassi sono stati riscontrati nella razza Valle del Belice. Le informazioni generate da questo studio potrebbero essere utilizzate per gli studi di associazione, nonché per lo sviluppo di programmi di selezione e miglioramento genetico.
sicilian sheep and cattle breeds,β-lactoglobulin, single nucleotide polymorphism, microsatellite markers,phylogenetic analysis, genetic diversity, population structure, linkage disequilibrium,Ovine and Bovine SNP50K BeadChip.
Mastrangelo, . (2014). Application of molecular markers to investigate genetic diversity in Sicilian livestock.
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