Messa a punto di un protocollo sperimentale per la ricerca di Enterovirus in sedimenti marini

The discharge of domestic sewage effluent bearing pathogenic enteric viruses into estuaries and coastal waters, has been demonstrated to pose a public health risk. Enteric virus are often discovered in water for human use and in fish origin foods, as shellfish. In consideration of the importance of the sea for Sicilian economy, it is significant to consider as a public health problems, those related to the fishing and fish culture. At moment, Italian rules for sea water, shellfish and sediments controls (D.P.R. 470/82, D. Leg 530/92 and D.M. del 24/01/1996 ) establish protocols only for bacteriological analysis, to research some fecal contamination indicators as Enterococcus, Streptococcus and Salmonella. Virological analysis of marine sediments is very important, because they represent a “reservoir” of viruses and pose a potential risk for water contamination. Therefore, it is important to optimize an operative and applicable diagnostic tool to control and warrant environmental and fishing yield health (Total Quality). In this study, Authors optimize a method to elute and concentrate viruses from marine sediments samples, through an experimental infection of them, with Hepatitis A virus (HAV). The virus detection was performed through a specific “seminested” RT-PCR and an in vitro virus isolation in FRhK-4 cell monolayers. Then, 162 marine sediments samples, taken out from various Sicilian coast areas, were analyzed using the described protocol and tested for Enterovirus and HAV assay, using two specific seminested RT-PCR and cell colture isolation on BGM (buffalo green monkey) and FRhK4 (foetal rhesus monkey kidney).

In riferimento al Decreto Ministeriale del 24/01/1996, il controllo dei fondali marini utilizzati per il ripascimento dei litorali, costituisce un passo importante per la valutazione della salubrità dell’ambiente marino e dei prodotti ittici da allevamento, con particolare riferimento alla coltivazione di molluschi eduli lamellibranchi. Diversi studi, infatti, hanno dimostrato come i sedimenti, per le loro caratteristiche chimico-fisiche, rappresentano dei “serbatoi” di agenti microbici di varia natura che, da qui possono essere risospesi nelle acque, compromettendo la salubrità dell’ambiente. Poiché i molluschi eduli lamellibranchi sono organismi filtratori e trattengono agenti patogeni causa di malattie nell’uomo, è importante conoscere il livello di contaminazione microbiologica dell’ambiente in cui essi sono allevati. In quest’ottica, l’analisi virologica di campioni ambientali, assume una particolare importanza, in considerazione di alcune caratteristiche peculiari dei virus, tra cui l’elevata resistenza nell’ambiente, la bassa carica infettante, nonché l’elevata variabilità genetica che pone il rischio di impreviste emergenze sanitarie. I controlli delle acque di mare e dei molluschi sono regolamentati rispettivamente dal D.P.R. 470/86 e dal D. Leg 530/92, i quali prevedono la ricerca di batteri indicatori di contaminazione fecale (Coliformi, Streptococchi e Salmonella) definendone i limiti quantitativi e i protocolli operativi e lasciando, invece, facoltativa le ricerca di Enterovirus. Pertanto, in mancanza di protocolli standardizzati per la ricerca di virus, un utile approccio al problema è rappresentato dalla ottimizzazione di metodi diagnostici sensibili, in grado di rilevare tali patogeni nei campioni di origine ambientale. Gli A.A., nel presente lavoro, hanno messo a punto una metodica di estrazione e concentrazione di agenti virali dai sedimenti marini, attraverso una prova di contaminazione sperimentale di tale matrice con il virus dell’Epatite A (HAV). La ricerca del virus nei campioni pretrattati è stata eseguita attraverso l’uso di una specifica “seminested” RT-PCR seguita dall’isolamento in colture cellulari permissive FRhK-4 (foetal rhesus monkey kidney). Il protocollo ottimizzato, è stato adottato successivamente, per analizzare 162 campioni di sedimenti marini, prelevati in aree costiere della Sicilia occidentale ed orientale in cui sono presenti allevamenti di molluschi. In particolare, i sedimenti sono stati analizzati per la ricerca di Enterovirus ed HAV attraverso due specifiche RT-PCR ed attraverso tecniche di isolamento virale, rispettivamente in BGM (buffalo green monkey ) e FRhK4.